循环肿瘤细胞检测原理及其应用
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原理：CTCs具有某些特殊的生物标志物，包括上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）以及肿瘤特异性抗原 因此利用肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，继而在外加磁场中与磁珠吸 附的细胞滞留在磁场中或定向移动到指定区域从而使肿瘤细胞得以从血液中分离出来
04 循环肿瘤细胞检测
CTCs的鉴定：如何鉴定所获 取的细胞为CTCs?
*将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮
细胞等区分开来。
CTC的富集：如何获 取CTCs?
*从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞
自自强强不不息息 厚厚德德载载物物
循环肿瘤细胞富集原理及方法
Principle and method of circulating tumor cell enrichment
02 CellSearch自动样本处理过程
知自行强合不一息、 厚经 德世 载致 物用
T s i n g hCue an t Ur anli vSeorustiht yU on if v Ce rhsi int ay
循环肿瘤细胞鉴定原理及方法
Principle and method of identification of circulating tumor cells
CellSearch系统在循环肿瘤 细胞检测中的应用
Central South University
自知 强 行 不 合 息 一 、厚经德世载致物用
02 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
原理： 是基于组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后DNA水平的异常，这些 mRNA不表达于正常外周血细胞，所以在外周血中检测到特异mRNA可以间接提 示CTCs的存在。
优点： 灵敏度高、可重复性好、价格低廉
不足之处： mRNA不稳定； 需破坏CTCs，无法计数及形态学观察； 取样时上皮细胞污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达可造成假阳性
的肿瘤细胞作为“种子”，当
癌症转移过程中发挥了非常重要的
遇到适合的器官、组织的基质
作用，但由于当时技术的限制，对
环境，即“土壤”时，就会在
这一现象的研究未能深入
此定居、生长即发生肿瘤的转
移，从而部分解释了肿瘤原发
灶与转移灶之间的关系
最终定义
2005年，Pachm anm将CTCs正
式定义为自发或因诊疗操作由实体
不足之处：肿瘤细胞表面抗原表达的不均
一性，在一定程度上降低了检测的敏感性
自强不息 厚德载物
Tsinghua University of China
02 流式细胞术（FCM）
自源自文库不息 厚德载物
原理： 根据白细胞表达CD45抗原、CK阳性CTCs表 达EpCAM，采用不同荧光素标记的抗CD45 和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选 CK阳性细胞的CTC（CD45- EpCAM+）
Time from Baseline (Months)
2004 获得美 国FDA批准用 于临床 1999-2003 大量
临床实验建立起
CellSearch与
CTC的临床相关 90年代中期开始数据 摸索捕获、分析
CTC的方法
1983 磁流体
自强不息 厚德载物
2010.1 中国 CTC在
2009 Cleveland Clinic 复发转移乳腺癌上 十大医学突破第一名 的应用注册实验
自强不息 厚德载物
Tsinghua University of China
自强不息 厚德载物
CellSearch系统在循环肿瘤细胞 检测中的应用
The CellSearch system and its application
02 CellSearch CTC 检测技术发展历程
%Probability of Survival
优点： 操作简便、成本低
不足之处： 一般要求血量较大，15-30ml； 缺乏特异性, 灵敏度也较低； CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞； 操作过程中易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失
10 基于物理性质的分离捕获方法
优点： 血液中捕获肿瘤细胞的效率达到70%； 无标记，细胞保存良好活性
不足之处： 细胞的介电性能会逐渐变化，必须在较短的时间内完成； 承载介质的电导率必须适当的控制在一个较低的范围
三、基于细胞电学性能分离 原理：细胞可被看作是一种电中性的但是可 以被极化的电介质粒子。因此, 当细胞处于 电场中时, 将产生电偶极矩，电偶极矩的大 小和方向主要依赖于细胞的介电性能。不同 的细胞具有不同的介电性能，这成为分离肿 瘤细胞的依据
在实际应用中, 当不同的细胞处于电场中时, 他们 将受到不同的电场力。因此, 肿瘤细胞可以通过 电旋转 (Electrorotation) 或者双向电泳 (Dielectrophoresis, DEP) 的方法得到分离富集
DAPI – 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）
厚德载物
Tsinghua University of China
02 CellSearch系统概览
第一个标准化，自动化的循环肿瘤细胞捕获计数平台
知自行强合不一息、 厚经 德世 载致 物用
T s i n g hCue an t Ur anli vSeorustiht yU on if v Ce rhsi int ay
不足之处： 单克隆抗体昂贵； 尚无具有普适性的肿瘤细胞表面抗原； 敏感性一定程度上受到CTCs表面抗原表达的制约； CTCs经历上皮间质化过程(EMT)中，丢失EpCAM这些特异性的分子
自强不息 厚德载物
自强不息 厚德载物
循环肿瘤细胞鉴定原理及方法
Principle and method of identification of circulating tumor cells
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0
<5 CTCs n=90 (51%)
Logrank p < 0.0001
10.9 Months
>5 CTCs n=87 (49%)
21.9 Months
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
优点： 可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析
不足之处： 需要的血液样本量大； 缺乏规范的临床操作方法； 肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，在一定程度上 降低了检测的敏感性
T s i n g hCue an t Ur anli vSeorustiht yU on if v Ce rhsi int ay
循环肿瘤细胞检测的背景与意义
Background and significance of the CTCs
T s i n gCheunat r Ua ln iSv oe ur st hi t yU noifv eCrhsi int ay
01 循环肿瘤细胞的发展（Circulating Tumor Cells，CTCs）
Tsinghua University of China
05 循环肿瘤细胞富集
目前对于CTCs的富集主要根据： 物理特性（密度和体积） 分子生物学特性（免疫磁性和浸润能力）
06 基于物理性质的分离捕获方法
一、基于肿瘤细胞大小及机械性能分离 原理：主要依赖于CTCs (15~30μm) 相对于血 细胞 (8~11μm) 有较大的体积
自强不息 厚德载物
02 免疫磁性分离
CellsearchTM系统/CTC芯片（CTC-chip）
• 芯片的表层分布了78 000个包被抗EpCAM 抗体的微柱点
• 血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合 粘附在芯片上
自强不息 厚德载物
02 免疫磁性分离
优点： 方便、有效； 可获取较高纯度的肿瘤细胞； 富集到具有完整的细胞形态
梯度分布： 血浆成分 单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞、肿瘤细胞等） 分离液 中性粒细胞和最下层的红细胞
09 基于物理性质的分离捕获方法
自强不息 厚德载物
OncoQuick系统 使用一种专用的50 mL试管，内置多孔屏障， 其下为密度梯度分离液，使用时将标本置于屏障 之上，从而避免在离心之前与分离液混合而污染
循环肿瘤细胞的检测原理及其应用
Contents .
目 录
知行合一、经世致用
循环肿瘤细胞检测的背景与意义
Background and significance of the topic
循环肿瘤细胞富集原理及方法
Principle and method of circulating tumor cell enrichment
瘤或转移灶释放进入外周血循环的
肿瘤细胞。
自强不息 厚德载物
Central South University
02 循环肿瘤细胞CTC
研究意义： ①深入研究CTCs有助于对肿瘤转移机制进一步了解，为抗肿瘤转移的 治疗提供新的依据； ②CTCs的检测有助于早期转移肿瘤患者的诊断、监测术后患者肿瘤的 复发与转移； ③有助于评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗 策略； ④。。。。。。
恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的主要原因之一
种子和土壤学说
循环肿瘤细胞的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的根源
CTCs的首次发现
Thomas Ashworth在癌症患者血液
该学说认为肿瘤转移的发生和
中发现与原发肿瘤细胞体积和形态
发展，是处于活跃或活化状态
相似的细胞。他推测，这些细胞在
2009 Prix Galien USA 2011.5 CTC在小细
最佳医学技术奖
胞肺癌上的应用实
验研究
2012.8 获得中国
CFDA批准用于临床
02 CellSearch检测技术的基本原理
检测外周血循环中的上皮源性的循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞表型 EpCAM+ and Cytokeratins 8, 18+, and/or 19+ CD45-
因此, 多种微孔滤膜、尺寸/形变依赖的微流控芯片 装置的方法得到了广泛研究
自强不息 厚德载物
09 基于物理性质的分离捕获方法
二、基于细胞密度离心分离 原理：基于血液中各种正常细胞与CTCs密度的 差别，利用其在密度梯度介质（如Ficoll-Paque 介质）中的沉降系数不同，将细胞悬液或匀浆置 于介质的顶部，通过重力或离心力的作用，用分 离液将CTCs与其它细胞层分离
癌细胞从原位脱离 侵犯血液循环，在循环中存活 渗出进入远端器官 在继发部位增殖
01 循环肿瘤细胞检测难点
02 循环肿瘤细胞检测难点
异质性
细胞表面抗原标志物表 达差异
携带不同的分子信息
转移潜力差异
03
不同形态： 单细胞CTC 细胞团CTM 血小板包裹的CTC
不同表型： 上皮细胞表型 间质细胞表型（经历EMT) 混合表型
完整的细胞 – 上皮源性细胞碎片也会被捕获到，
但并不会被计数
肿瘤细胞
白细胞
抗 EpCAM 磁珠
EpCAM 抗原 CD45 抗原 CK 抗原 荧光染料 抗 CD45-APC 染料 抗 CK-PE 染料
自强不息
EpCAM – 上皮细胞粘附分子 CK – 细胞角蛋白
APC – 异藻蓝蛋白荧光染料 PE – 藻红蛋白荧光染料
02 CTCs的鉴定
如何鉴定所获取的细胞为CTCs?
免疫细胞化学技术 （ICC）
流式细胞术 （FCM）
逆转录聚合酶链反应 定量聚合酶链反应
（RTPCR）
（qPCR）
自强不息 厚德载物
Tsinghua University of China
02 免疫细胞化学技术（ICC）
原理
荧光染料
荧光染料
是以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和细胞化学呈色反
自强不息 厚德载物
02 基于分子生物学特性的分离捕获方法
肿瘤细胞表面特异性抗原标志物的表达 抗原-抗体特异性结合，理论上可以同时实现对肿瘤细胞捕获和检测。
免疫磁珠分离：最常见且有效地检测捕获脱落肿瘤细胞的方法 阳性富集—捕获肿瘤细胞 负性筛选—去除非肿瘤细胞（如白细胞、红细胞）
02 免疫磁性分离
应，对相应抗原进行定位、定性和定量的
技术。
目前选择的循环肿瘤细胞的相关抗原包括
EpCAM、上皮角质蛋白（CKs）、上皮细胞膜
特异性抗原、肿瘤相关糖蛋白（TAG）或特异
性标志物（如HER2、抗乳球蛋白等）
• CTC的免疫荧光染色特性：EpCAM＋ CK＋ DAPI＋ CD45－ 优点：在于肿瘤细胞膜未被破坏，可以进 • 白细胞的免疫荧光染色特性：EpCAM－ CK－ DAPI＋ CD45＋行细胞大小和形态学分析
04 循环肿瘤细胞检测
CTCs的鉴定：如何鉴定所获 取的细胞为CTCs?
*将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮
细胞等区分开来。
CTC的富集：如何获 取CTCs?
*从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞
自自强强不不息息 厚厚德德载载物物
循环肿瘤细胞富集原理及方法
Principle and method of circulating tumor cell enrichment
02 CellSearch自动样本处理过程
知自行强合不一息、 厚经 德世 载致 物用
T s i n g hCue an t Ur anli vSeorustiht yU on if v Ce rhsi int ay
循环肿瘤细胞鉴定原理及方法
Principle and method of identification of circulating tumor cells
CellSearch系统在循环肿瘤 细胞检测中的应用
Central South University
自知 强 行 不 合 息 一 、厚经德世载致物用
02 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
原理： 是基于组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后DNA水平的异常，这些 mRNA不表达于正常外周血细胞，所以在外周血中检测到特异mRNA可以间接提 示CTCs的存在。
优点： 灵敏度高、可重复性好、价格低廉
不足之处： mRNA不稳定； 需破坏CTCs，无法计数及形态学观察； 取样时上皮细胞污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达可造成假阳性
的肿瘤细胞作为“种子”，当
癌症转移过程中发挥了非常重要的
遇到适合的器官、组织的基质
作用，但由于当时技术的限制，对
环境，即“土壤”时，就会在
这一现象的研究未能深入
此定居、生长即发生肿瘤的转
移，从而部分解释了肿瘤原发
灶与转移灶之间的关系
最终定义
2005年，Pachm anm将CTCs正
式定义为自发或因诊疗操作由实体
不足之处：肿瘤细胞表面抗原表达的不均
一性，在一定程度上降低了检测的敏感性
自强不息 厚德载物
Tsinghua University of China
02 流式细胞术（FCM）
自源自文库不息 厚德载物
原理： 根据白细胞表达CD45抗原、CK阳性CTCs表 达EpCAM，采用不同荧光素标记的抗CD45 和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选 CK阳性细胞的CTC（CD45- EpCAM+）
Time from Baseline (Months)
2004 获得美 国FDA批准用 于临床 1999-2003 大量
临床实验建立起
CellSearch与
CTC的临床相关 90年代中期开始数据 摸索捕获、分析
CTC的方法
1983 磁流体
自强不息 厚德载物
2010.1 中国 CTC在
2009 Cleveland Clinic 复发转移乳腺癌上 十大医学突破第一名 的应用注册实验
自强不息 厚德载物
Tsinghua University of China
自强不息 厚德载物
CellSearch系统在循环肿瘤细胞 检测中的应用
The CellSearch system and its application
02 CellSearch CTC 检测技术发展历程
%Probability of Survival
优点： 操作简便、成本低
不足之处： 一般要求血量较大，15-30ml； 缺乏特异性, 灵敏度也较低； CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞； 操作过程中易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失
10 基于物理性质的分离捕获方法
优点： 血液中捕获肿瘤细胞的效率达到70%； 无标记，细胞保存良好活性
不足之处： 细胞的介电性能会逐渐变化，必须在较短的时间内完成； 承载介质的电导率必须适当的控制在一个较低的范围
三、基于细胞电学性能分离 原理：细胞可被看作是一种电中性的但是可 以被极化的电介质粒子。因此, 当细胞处于 电场中时, 将产生电偶极矩，电偶极矩的大 小和方向主要依赖于细胞的介电性能。不同 的细胞具有不同的介电性能，这成为分离肿 瘤细胞的依据
在实际应用中, 当不同的细胞处于电场中时, 他们 将受到不同的电场力。因此, 肿瘤细胞可以通过 电旋转 (Electrorotation) 或者双向电泳 (Dielectrophoresis, DEP) 的方法得到分离富集
DAPI – 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）
厚德载物
Tsinghua University of China
02 CellSearch系统概览
第一个标准化，自动化的循环肿瘤细胞捕获计数平台
知自行强合不一息、 厚经 德世 载致 物用
T s i n g hCue an t Ur anli vSeorustiht yU on if v Ce rhsi int ay
不足之处： 单克隆抗体昂贵； 尚无具有普适性的肿瘤细胞表面抗原； 敏感性一定程度上受到CTCs表面抗原表达的制约； CTCs经历上皮间质化过程(EMT)中，丢失EpCAM这些特异性的分子
自强不息 厚德载物
自强不息 厚德载物
循环肿瘤细胞鉴定原理及方法
Principle and method of identification of circulating tumor cells
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0
<5 CTCs n=90 (51%)
Logrank p < 0.0001
10.9 Months
>5 CTCs n=87 (49%)
21.9 Months
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
优点： 可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析
不足之处： 需要的血液样本量大； 缺乏规范的临床操作方法； 肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，在一定程度上 降低了检测的敏感性
T s i n g hCue an t Ur anli vSeorustiht yU on if v Ce rhsi int ay
循环肿瘤细胞检测的背景与意义
Background and significance of the CTCs
T s i n gCheunat r Ua ln iSv oe ur st hi t yU noifv eCrhsi int ay
01 循环肿瘤细胞的发展（Circulating Tumor Cells，CTCs）
Tsinghua University of China
05 循环肿瘤细胞富集
目前对于CTCs的富集主要根据： 物理特性（密度和体积） 分子生物学特性（免疫磁性和浸润能力）
06 基于物理性质的分离捕获方法
一、基于肿瘤细胞大小及机械性能分离 原理：主要依赖于CTCs (15~30μm) 相对于血 细胞 (8~11μm) 有较大的体积
自强不息 厚德载物
02 免疫磁性分离
CellsearchTM系统/CTC芯片（CTC-chip）
• 芯片的表层分布了78 000个包被抗EpCAM 抗体的微柱点
• 血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合 粘附在芯片上
自强不息 厚德载物
02 免疫磁性分离
优点： 方便、有效； 可获取较高纯度的肿瘤细胞； 富集到具有完整的细胞形态
梯度分布： 血浆成分 单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞、肿瘤细胞等） 分离液 中性粒细胞和最下层的红细胞
09 基于物理性质的分离捕获方法
自强不息 厚德载物
OncoQuick系统 使用一种专用的50 mL试管，内置多孔屏障， 其下为密度梯度分离液，使用时将标本置于屏障 之上，从而避免在离心之前与分离液混合而污染
循环肿瘤细胞的检测原理及其应用
Contents .
目 录
知行合一、经世致用
循环肿瘤细胞检测的背景与意义
Background and significance of the topic
循环肿瘤细胞富集原理及方法
Principle and method of circulating tumor cell enrichment
瘤或转移灶释放进入外周血循环的
肿瘤细胞。
自强不息 厚德载物
Central South University
02 循环肿瘤细胞CTC
研究意义： ①深入研究CTCs有助于对肿瘤转移机制进一步了解，为抗肿瘤转移的 治疗提供新的依据； ②CTCs的检测有助于早期转移肿瘤患者的诊断、监测术后患者肿瘤的 复发与转移； ③有助于评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗 策略； ④。。。。。。
恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的主要原因之一
种子和土壤学说
循环肿瘤细胞的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的根源
CTCs的首次发现
Thomas Ashworth在癌症患者血液
该学说认为肿瘤转移的发生和
中发现与原发肿瘤细胞体积和形态
发展，是处于活跃或活化状态
相似的细胞。他推测，这些细胞在
2009 Prix Galien USA 2011.5 CTC在小细
最佳医学技术奖
胞肺癌上的应用实
验研究
2012.8 获得中国
CFDA批准用于临床
02 CellSearch检测技术的基本原理
检测外周血循环中的上皮源性的循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞表型 EpCAM+ and Cytokeratins 8, 18+, and/or 19+ CD45-
因此, 多种微孔滤膜、尺寸/形变依赖的微流控芯片 装置的方法得到了广泛研究
自强不息 厚德载物
09 基于物理性质的分离捕获方法
二、基于细胞密度离心分离 原理：基于血液中各种正常细胞与CTCs密度的 差别，利用其在密度梯度介质（如Ficoll-Paque 介质）中的沉降系数不同，将细胞悬液或匀浆置 于介质的顶部，通过重力或离心力的作用，用分 离液将CTCs与其它细胞层分离
癌细胞从原位脱离 侵犯血液循环，在循环中存活 渗出进入远端器官 在继发部位增殖
01 循环肿瘤细胞检测难点
02 循环肿瘤细胞检测难点
异质性
细胞表面抗原标志物表 达差异
携带不同的分子信息
转移潜力差异
03
不同形态： 单细胞CTC 细胞团CTM 血小板包裹的CTC
不同表型： 上皮细胞表型 间质细胞表型（经历EMT) 混合表型
完整的细胞 – 上皮源性细胞碎片也会被捕获到，
但并不会被计数
肿瘤细胞
白细胞
抗 EpCAM 磁珠
EpCAM 抗原 CD45 抗原 CK 抗原 荧光染料 抗 CD45-APC 染料 抗 CK-PE 染料
自强不息
EpCAM – 上皮细胞粘附分子 CK – 细胞角蛋白
APC – 异藻蓝蛋白荧光染料 PE – 藻红蛋白荧光染料
02 CTCs的鉴定
如何鉴定所获取的细胞为CTCs?
免疫细胞化学技术 （ICC）
流式细胞术 （FCM）
逆转录聚合酶链反应 定量聚合酶链反应
（RTPCR）
（qPCR）
自强不息 厚德载物
Tsinghua University of China
02 免疫细胞化学技术（ICC）
原理
荧光染料
荧光染料
是以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和细胞化学呈色反
自强不息 厚德载物
02 基于分子生物学特性的分离捕获方法
肿瘤细胞表面特异性抗原标志物的表达 抗原-抗体特异性结合，理论上可以同时实现对肿瘤细胞捕获和检测。
免疫磁珠分离：最常见且有效地检测捕获脱落肿瘤细胞的方法 阳性富集—捕获肿瘤细胞 负性筛选—去除非肿瘤细胞（如白细胞、红细胞）
02 免疫磁性分离
应，对相应抗原进行定位、定性和定量的
技术。
目前选择的循环肿瘤细胞的相关抗原包括
EpCAM、上皮角质蛋白（CKs）、上皮细胞膜
特异性抗原、肿瘤相关糖蛋白（TAG）或特异
性标志物（如HER2、抗乳球蛋白等）
• CTC的免疫荧光染色特性：EpCAM＋ CK＋ DAPI＋ CD45－ 优点：在于肿瘤细胞膜未被破坏，可以进 • 白细胞的免疫荧光染色特性：EpCAM－ CK－ DAPI＋ CD45＋行细胞大小和形态学分析