蛋白质的分离 纯化和鉴定

本章主要Hale Waihona Puke Baidu容
氨基酸 肽 蛋白质的结构、重要性质、结构
与功能关系和蛋白质的分离纯化
巯基乙醇：破坏-S-S-
电泳过程
蛋白质电泳迁移率取 决于相对分子质量， 与其所带电荷和分子 形状无关
Log Mr=a – bμ
μ=样品迁移距离/前沿迁移 距离
六、蛋白质含量的测定
总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚 法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、 紫外吸收法
特定蛋白组分的含量分析：酶、激素等测 定活性
有机溶剂沉淀法：常用丙酮和乙醇。特点为分 辨率稍高，高浓度溶剂易引起变性
等电点沉淀法：蛋白质能保持天然构象和活性、 沉淀不完全
吸附法：常用硅胶、活性炭、氧化铝等。适用 于处理大量样品
超滤法
四、纯化
1、离子交换层析 2、凝胶过滤 原理：根据蛋白质分子大小的不同进行分离 介质特点：内部多孔的网状结构 常用的凝胶：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、
3、疏水作用层析
原理：利用蛋白质表面的非极性基团和介质上 的疏水基团间的疏水作用来分离蛋白质的层析 方法。
介质：以琼脂糖为母体，偶联上非极性基团。 如苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。
洗脱：高离子强度增加疏水作用。高浓度硫酸 铵存在下将蛋白质吸附在介质上，然后逐渐降 低硫酸铵的浓度进行洗脱。
4、亲和层析
3-11 蛋白质的分离、纯化和鉴定
一、细胞破碎
动物细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波破碎法 植物组织：匀浆器、石英砂研磨 微生物：溶菌酶+超声波
二、抽提
选择合适的溶剂 避免目的蛋白质的变性 在低温下进行
三、分离
盐析法：常用硫酸铵、氯化钠、硫酸钠、硫酸 镁等。特点为安全、简便、分辨率不高
原理：根据蛋白质能与特异的配体相结合而设 计的方法。如抗体与抗原、激素与受体、酶与 底物、酶与抑制剂等。
五、鉴定
1、纯度鉴定：电泳法、HPLC法 2、相对分子质量的测定：超离心法、凝胶过
滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 3、等电点的测定 4、生物活性的测定
SDS：变性剂破坏分子中的-H和疏水作用。改变 蛋白质的带电状态、改变蛋白质单体分子构象。
三聚氰胺
结构
用途：广泛应用于木材、塑料、涂料、造 纸、纺织、皮革、电气、医药等行业
根据美国食物及药物管理局的标准，三聚 氰胺可容忍摄入量为每日0.63毫克/公斤 体重
假蛋白原理：蛋白质主要由氨基酸组成， 其含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的 分子中含氮量为66％左右。通用的蛋白质 测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮 量来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰 胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高，从 而使劣质食品通过食品检验机构的测试。
琼脂糖凝胶 优点：分离条件温和，不影响样品的生物活性；
样品损失小，回收率高。
习题
指出下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱（蛋白质分 离范围从5000到400000）时的洗脱顺序。 肌红蛋白：16900； 过氧化氢酶：247500； 细胞色素C：13370； 肌球蛋白：524800； 胰凝乳蛋白酶原：23240； 血清清蛋白：68500。