光激化学发光技术介绍(课堂PPT)

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蛋白酶(2) ACE
ACE 切割
Biotin- angiotensin I
anti-angiotensin II- FG
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蛋白酶(2) ACE
GG-SA
Biotin - angiotensin I I anti-angiotensin II- FG
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蛋白－DNA ERa-DNA
Biotin -ERa DNA -digoxigenin
anti-digoxigenin-FG
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蛋白－DNA ERa-ERE
GG-SA
Biotin -ERa DNA -digoxigenin
anti-digoxigenin-FG
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当前成功应用实例
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HBsAg
GG-SA
Biotin-Anti-HBs
HBsAg
Anti-HBs-FG
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Anti-HBs
GG-SA
Biotin -TNFa sTNFR1 anti-TNFR1 IgG Protein A- FG
16Βιβλιοθήκη Baidu
配体－受体(2)
环磷酸腺苷 cAMP
Biotin- cAMP
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anti-cAMP- FG
配体－受体(2)
环磷酸腺苷 cAMP
GG-SA
Biotin- cAMP
18
anti-cAMP- FG
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LiCA的技术特点（三）
➢ 稳定 • 均相环境使反应更充分 • 免洗操作杜绝随机误差和交叉污染 • 感光和发光的有机分子受到微粒的保护，环境稳定和安全 • 溶液中的氧浓度是一个常数 • 不易受到pH值、离子强度和温度的影响
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广泛应用
➢ 临床免疫的各项检测 ➢ 生命科学的基础研究 ➢ 新药的筛选 ➢ 标记简便 ➢ 检测过程简单
感光微球
A
C
发光微球
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LiCA的技术特点（一）
➢ 高灵敏度 • 信号产生逐级放大的结果 • 每个感光微粒释放出近6万个离子氧 • 离子氧作用于二甲基噻吩，产生大量紫外光 • 紫外光激发镧系元素 实际检测能力为10-15摩尔 理论检测能力为10-18摩尔
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LiCA的技术特点（二）
➢ 低本底 • 时间分辨模式采集光信号（延迟150 ms），天然荧光的寿命 小于100 ns • 采用680 nm红光激发，生物样品中的荧光物质不敏感 • 发射光的波长比激发光的波长短，能量更高，有别于荧光， 有效避免荧光物质干扰
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激酶
Akt
Akt
GG-SA
Biotin -Gsk3
anti-Gsk3 IgG Protein A- FG
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蛋白－蛋白 p53/HDM2
Biotin -p53
HDM2-GST
Anti-GST- FG
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蛋白－蛋白 p53/HDM2
GG-SA
Biotin -p53
HDM2-GST
Anti-GST- FG
GG-SA Biotin-HBsAg
Anti-HBs
HBsAg- FG
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HBeAg
GG-SA
Biotin-Anti-HBe
HBeAg
Anti-HBe- FG
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Anti-HBe
Sample Anti-HBe
GG-SA
Biotin-Anti-HBe
中和HBeAg
Anti-HBe- FG
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光激化学发光（LiCA）
Light Initiated Chemiluminescence Assay
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光激化学发光（LiCA）介绍
➢ 以高分子微粒为基础 • 两种微粒近距离 • 离子氧能量传递
➢ 主要特点： • 高灵敏度 • 低本底 • 稳定 – 均相 – 免洗
➢ 广泛应用于生物分子间的相互作用
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免疫(1)
肿瘤坏死因子 TNFa
Biotin - anti-TNFa
TNFa
anti-TNFa- FG
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免疫(1)
肿瘤坏死因子 TNFa
GG-SA
Biotin - anti-TNFa
TNFa
anti-TNFa- FG
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免疫(2)
肿瘤坏死因子 TNFa
GG-SA Biotin-anti-TNFa TNFa
anti-TNFa Protein A- FG
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免疫(2)
肿瘤坏死因子 TNFa
GG-SA
Biotin-anti-TNFa TNFa
anti-TNFa Protein A- FG
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蛋白酶(1)
组织蛋白酶 Cathepsin D
Cathepsin D 水解
GG-SA
Biotin - substrate - digoxigenin anti-digoxigenin- FG
激酶 Akt
Biotin -Gsk3
anti-Gsk3 IgG Protein A- FG
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激酶 Akt
Biotin -Gsk3
anti-Gsk3 IgG Protein A- FG
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激酶 Akt
Akt 磷酸化
GG-SA
Biotin -Gsk3
anti-Gsk3 IgG Protein A- FG
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微粒的组成
➢ 感光微粒内含感光化合物 ➢ 发光微粒内含发光化合物和镧系元素 ➢ 微粒直径188nm，表面覆盖水凝胶 ➢ 共价连接 ➢ 增大的表面积 ➢ 成百上千个生物分子，捕获目标分子
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LiCA发光原理
➢ 核心原理是能量的近距离转移 ➢ 转移的介质是高能态离子氧 ➢ 红色激光680nm照射，感光微粒释放离子氧（4微秒），传播
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基本包被模式
GG-Streptavidin（SA）
FG- Antibody（Ab）
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基本反应模式
biotin-antigen
primary Ab
secondary Ab (or protein A, G, LA)
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应用类型 ➢ 配体－受体 ➢ 激酶 ➢ 蛋白－蛋白 ➢ 免疫 ➢ 蛋白酶 ➢ 蛋白－DNA
直径200nm，发光微粒（520～618nm），高能级的光 ➢ 反应的基础有赖于两种微粒的相互接近 ➢ 反应体系中，微粒的浓度很低，碰撞机率很低，本底信号微弱
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激发光 680 nm
原理 (1)
1O2
发射光 520-620 nm
感光微球
A
B
200nm
发光微球
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激发光 680 nm
原理 (2)
O2-
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配体－受体(1) TNFa-sTNFR1
Biotin -TNFa sTNFR1 anti-TNFR1 IgG Protein A- FG
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配体－受体(1) TNFa-sTNFR1
GG-SA
Biotin -TNFa sTNFR1 anti-TNFR1 IgG Protein A- FG
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配体－受体(1) TNFa-sTNFR1