银杏叶提取物对戊四氮诱导大鼠癫痫发作和Cav3.2表达影响

银杏叶提取物对戊四氮诱导大鼠癫痫发作和Cav3.2表达的影响【摘要】目的探讨银杏叶提取物（gbe）对戊四氮（ptz）慢性致痫大鼠模型癫痫发作的影响及脑保护作用。方法健康成年雄性sd大鼠40只，随机分为4组：ptz致痫组、ptz+丙戊酸（vpa）组、ptz+vpa+ gbe组、生理盐水（ns）对照组，每组10只，观察各组大鼠的行为学、脑电图（eeg）、电迷宫正确率和颞叶海马t型ca2+通道cav3.2表达变化。结果ptz+vpa 组、ptz+vpa+gbe组和ns组发作级别为0-ⅱ级，eeg正常或少量棘慢波，eeg总功率差值及颞叶海马cav3.2水平较ptz组显著降低，差别有统计学意义（p＜0.05）；相比于ptz+vpa 组，ptz+vpa+gbe组颞叶海马cav3.2表达明显减少，差别有统计学意义（p＜0.05）。结论 gbe能降低cav3.2水平，显著降低癫痫大鼠发作级别、减少脑部异常放电和改善认知功能，有辅助抗癫痫和脑保护作用。

【关键词】戊四氮（ptz）；银杏叶提取物（gbe）；丙戊酸（vpa）；脑电图（eeg）；电迷宫

癫痫是由大脑神经元突然过度异常放电所致的反复短暂中枢神

经系统功能失常为特征的慢性疾病，严重危害人类健康。其发病机制复杂，治疗靶点多样。当前的研究趋势之一是寻找具有神经保护作用的新型抗癫痫药。近年来，具有明显神经保护作用的银杏叶提取物(gbe)广泛用于心脑血管疾病的防治，仅少量涉及gbe对癫痫的干预。本实验用gbe、vpa干预戊四氮致痫大鼠，通过对其癫痫发作、认知功能和t型ca2+通道蛋白cav3.2表达的观察，探究gbe

对癫痫发作的影响及发作后脑损伤的保护作用。

1材料和方法

1.1试剂和仪器ptz、anti-calcium channel cav3.2 (a1h)（sigma公司），兔sp检测试剂盒sp-9001（北京中杉金桥生物技术有限公司），gbe（法国博福—益普生制药工业公司，含24%黄酮糖苷，6%萜类，其中银杏苦内酯占3.1%，白果内酯(又称银杏内酯)占

2.9%），日本光电4371f脑电图机，mg-20/3c 迷宫刺激器（张家港市生物医学仪器厂），德国lecia显微照像系统，biosens digital imaging systemv1.6分析系统。

1.2动物分组及模型制作成年雄性sd大鼠40只，体重250g左右，河南省实验动物中心提供，按随机数字表法分为4组，每组10只。ptz致痫组、ptz+丙戊酸（vpa）组、ptz+vpa+ gbe组、生理盐水（ns）对照组，分别标记为a组、b组、c组、d组。a-c组按照diehl[5]的方法制作大鼠点燃模型，即按35mg/kg腹腔注射（ip）10g/l ptz 生理盐水溶液，每日一次；b组在ip ptz之前1小时给予丙戊酸80mg/kg[2]灌胃（ig）；c组在ip ptz之前1.5小时给予银杏叶提取物100mg/kg[3] ，ip ptz之前1小时给予丙戊酸80mg/kg ig；d 组按3.5ml/kg腹腔注射生理盐水，每日一次。各组于每天下午3

点开始用药，实验周期为8周，其中c组在腹腔注射ptz之前的3天只给予gbe。

1.3观察方法

1.3.1 大鼠行为学评估指标根据racine分级法观察痫性发作级

别：0 级：无抽搐发作；ⅰ级：面部痉挛；ⅱ级：面部痉挛+节律性点头；ⅲ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛；ⅳ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立；ⅴ级：面部痉挛+节律性点头+前肢阵挛+后肢站立+跌倒；连续3天出现ⅳ级发作或达到ⅴ级发作判定为完全点燃。观察并记录大鼠腹腔注射ptz或生理盐水后1小时内，每只大鼠的行为学变化。

1.3.2 脑电图描记第八周末对40只实验大鼠进行eeg描记。方法为：用粗棉线套住大鼠4只脚固定于木板上，将3根特制针电极分别插入大鼠前额、左右颞叶部位头皮下，使三个插入点成为等腰三角形状，其中顶角为参考电极，用胶带固定电极和电线。

1.3.3 y型电迷宫正确率测定第8周，对40只sd大鼠进行电迷宫测试。y型电迷宫，又称三等分辐射式迷路箱,设置电压50-100v，延迟时间5秒。实验开始时，不通电，随机选择一臂作为起步区，将大鼠置于起步区，由于好奇心大鼠在三臂中探索3-5分钟，待大鼠稳定后将其放回起步区。选择起步区所之外任一区作为安全区，按下其对应的按键，安全区灯亮后5秒时，电刺激开始，大鼠最终逃到亮灯的安全区，30秒后熄灯，一次测试结束。

1.3.4 免疫组化染色在描记eeg后，各组大鼠10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔麻醉，10%甲醛全身灌注固定，然后断头取脑，将大脑置于10%甲醛中室温固定36小时，常规石蜡包埋。用切片机连续冠状切取颞叶海马脑组织，每片厚3μm。

1.4 统计学处理数据均为定量资料，结果用x+s表示。采用

spss10.0统计软件对a-d组的eeg、电迷宫正确反应率和颞叶海马平均积分光密度进行分析，设定p0.05)。即：癫痫可导致认知受损，vpa和gbe不能改善ptz致痫大鼠的认知功能。

表1 大鼠y型电迷宫测试结果

注：与a组比较，*p<0.05；与d组比较，#p<0.05

2.4cav

3.2免疫组化染色结果a组颞叶海马可见明显神经元空泡变性、神经细胞减少，海马锥体细胞排列层次紊乱。b、c组神经元空泡变性及神经细胞减少不明显，海马锥体细胞层次偶见紊乱。d 组颞叶海马无异常。由于正常脑组织也存在t型钙通道，因此正常颞叶海马可见少量cav3.2表达。而对于ptz致痫大鼠，cav3.2表达增多，在海马主要分布于ca1、ca3区，在颞叶各层分布无明显差异。实验中以pbs代替一抗作阴性对照，未发现有阳性染色。颞叶cav3.2表达：a组高于b、c、d组，差别有统计学意义(p＜0.05)；b组高于c、d组，差别有统计学意义(p＜0.05)； d组低于c组，差别有统计学意义(p＜0.05)；即癫痫大鼠颞叶cav3.2表达显著增加，gbe与vpa联用可显著降低cav3.2水平，效果优于vpa单一用药。

3讨论

戊四氮慢性点燃大鼠模型与人类颞叶癫痫的行为、脑电图改变、病理及药理特性非常相似。亚惊厥剂量反复诱导即可复制出具有颞叶点燃特征的癫痫模型。海马是点燃模型病理生理改变的主要部