脂肪酶高产菌株筛选材料方法

2 脂肪酶高产菌株筛选

2.1 前言

常见的筛选脂肪酶高产菌的方法是含甘油三酯琼脂平板法，我们以橄榄油为底物，溴甲酚紫为指示剂，通过平板法筛选脂肪酶高产菌株。

2.2 材料和方法

2.2.1 土样

从襄樊、武汉、十堰等地的油脂厂、油坊、奶牛场、食堂采集土样208份。

2.2.2 设备与试剂

本试验所用到的药品试剂除橄榄油外均为分析纯；橄榄油为国药集团化学试剂有限公司生产，化学纯。

试验仪器和设备如下：

OHAUS分析天平AR1530 奥豪斯国际贸易有限公司

乳化机CZD3 上海氟鲁克流体机械制造有限公司

磁力搅拌器79-2 金坛市新航仪器厂

灭菌锅YX-400B 上海三申医疗器械有限公司

超净工作台SW-CT-2FD 苏州净化设备有限公司

生化培养箱SPX-150B-Z上海博迅实业有限公司医疗设备厂

2.2.3 溶液配制

2％（w/v）的聚乙烯醇水溶液：称取聚乙烯醇固体20g，倾入1000mL蒸馏水中，然后边加热边搅拌直到聚乙烯醇全部溶解。静置冷却至室温备用。若有少量杂质不溶解，可通过滤纸过滤去除杂质。

橄榄油乳化液：分别量取橄榄油25mL和2％聚乙烯醇水溶液75mL，混合，置4℃平衡1h，然后10000r/min乳化三次，每次一分钟。4℃保存备用。若高温灭菌后产生分层，可充分振荡至分层现象消失，而无需重新乳化。

2.2.4 筛选培养基

平板粗筛培养基（％）：酵母膏0.1，蛋白胨0.2，硫酸铵0.2，橄榄油乳化液1.2，磷酸氢二钾0.1，氯化钾0.05，硫酸镁0.05，硫酸亚铁0.001，琼脂1.5。

平板复筛培养基组成（％）：蛋白胨1.0，蔗糖0.5，橄榄油乳化液1.2，硫酸铵0.1, 磷酸氢二钾0.1,氯化钾0.1,硫酸亚铁0.001，琼脂1.5。

摇瓶复筛液体培养基（％）:蛋白胨2.0，蔗糖1.0，橄榄油乳化液1.0，硫酸铵0.5，硫酸镁0.05，磷酸氢二钾0.2。

筛选培养基于121℃灭菌20min，平板粗筛培养基和平板复筛培养基从灭菌锅取出后，每升培养基冷却到60℃加入无菌的10mg/mL溴钾酚紫10mL，混匀，趁热倒平板。

2.2.5 筛选方法

平板初筛：称取10g土样，倾入100mL无菌水中，充分振荡10min后，移取1mL梯度稀释至10－6倍浓度，取10－4～10-6稀释液20µL～50µL涂平板，28℃培养72h，挑选有黄色变色圈和透明圈菌落，经划线或无菌水梯度稀释平板培养获得单菌落，PDA试管保藏供平板复筛。

平板复筛：将粗筛菌种穿刺接种在复筛平板上，每平板（d9cm）可接三株，于28℃培养72h。挑选变色圈和透明圈较大的菌株进行摇瓶复筛。

摇瓶复筛：平板复筛挑选出的菌株进行摇瓶复筛，250mL三角瓶装液50mL,28℃, 200r/min培养72h。发酵液离心（3000r/min,15min），取上清液测酶活。

脂肪酶活力测定：滴定法测酶活[109]。酶活力测定以橄榄油乳化液为底物, 底物4mL、Tris·HCl（pH7.20, 50mmol/L）5mL、发酵上清液1mL组成10mL反应体系，31℃水浴反应十分钟，然后加入95％乙醇10mL终止反应。酶催化水解脂肪酸量通过0.05mol/L NaOH滴定测得，加二滴1％酚酞指示滴定终点。在上述条件下，水解橄榄

油每分钟产生1µmol游离肪酶酸所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。

2.3 结果和讨论

208份土样经粗筛、平板复筛得产脂肪酶菌79株，然后分别发酵并测酶活，得酶活力在5.0U/mL以上菌6株，结果见表2.1。其中F044活力最高，为11.18U/mL。后鉴定为Aspergillus sp.。

表2.1 筛选结果

Table 2.1 The screening results of lipase-prodction microorganisms

K－1－1

3.4.21C40

F044

菌株 4.4.2

T.4.2

酶活（U/mL）7.00 5.25 11.18 8.50 9.05 8.30 分类青霉曲霉黑曲霉根霉毛霉青霉脂肪酶产生菌的筛选工艺相对比较成熟，本文在现有的筛选方法上进行了一些改进，将橄榄油为唯一碳源的粗筛平板改为低营养粗筛平板，在摇瓶复筛前插入富营养油脂平板复筛。在筛选过程中，发现许多菌株在初筛平板上出现了较大的变色圈，然后进行摇床发酵不能检测出酶活。原因可能是我们在初筛时以溴甲酚紫为指示剂，而一些菌株产生有机酸，也能够使菌株在平板上出现变色圈，另外，初筛平板碳源以橄榄油为碳源的低营养培养基，一些野生菌株在低营养时为了生长表现出脂肪酶活性，但在富营养的时候可能就不在需要表现出脂肪酶活性。而作为工业生产所需的菌种既要能够高产脂肪酶，又要具有经济效益，以橄榄油为碳源不仅价格昂贵，而且不能促使菌株很好的生长，生物量不高，故而我们在初筛和复筛间插入平板复筛，一方面从变色圈的有无和是否有透明圈剔除部分产酸菌株和不产脂肪酶菌株，另外一方面由于在初筛平板经过长时间培养，菌株生长情况复杂，会出现菌落间交接、重叠的情况，直接判断其是否产脂肪酶有一定的困难，通过复筛平板在相对简单的情况下比较变色圈和透明圈大小判断菌株酶活有无和高低，易行且可靠，在一定程度上增大了产脂肪酶野生菌株在粗筛平板上出现的概率，另外平板复筛又缩减了后期摇瓶复筛的工作