Lipstatin高产菌株筛选

从表４可以看出，当豆油浓度为１．５％（ｙ／ｙ）时， ｌｉｐｓｔａｔｉｎ产生菌的生长受到严重的抑制，同时发现随 着豆油浓度的增加，培养皿中菌落的生长速度也随之 变慢，且菌落变小。确定１．５％（ｖ／ｖ）剂量进行耐受突 变株的筛选，进一步对耐豆油变株的生产能力进行了 统计分析，其产量分布结果见图３。
从图３可以观察到耐豆油突变株中，ｌｉｐｓｔａｔｉｎ合 成能力高于出发菌株的占４２％，低于出发菌株的占 １０％，与出发菌株持平的占４８％。如此高的正变率，说 明了此筛选方法的合理性。
用群体传代的方法考察了高产菌株ＸＣ—ｌｐ一６９的 斜面传代稳定性，结果见表５。
表５
ＸＣ—ｌｐ一６９高产菌株的稳定性考察（／－ｇ／ｍ［）
表５结果显示，经过连续传５代，菌株ＸＣ—ｌｐ一６９ 的生产能力基本一致，说明菌株ＸＣ—ｌｐ一６９的高产性能 遗传特性稳定。 ３讨论
通过ＵＶ和微波复合筛选得到遗传性能稳定的 ｌｉｐｓｔａｔｉｎ高产菌株ＸＣ—ｌｐ一６９。
从图１、图２可以看出，ＯＴ一６３培养至发酵结束时 （５ｄ）分泌至胞外的ｌｉｐｓｔａｔｉｎ只有３５％，而ｗ一３９达 ５０％，比原来提高了１５％，且总的发酵效价也提高了 １８％。
推测微波的作用改变了菌体细胞膜的通透性，促 进了胞内ｌｉｐｓｔａｔｉｎ的外排，减轻了ｌｉｐｓｔａｔｉｎ对其自身
表１
冰箱保存菌株产生ｌｉｐｓｔａｔｉｎ的情况Ｑｌｇ／ｍ１）
（１）斜面培养条件培养温度（３０±０．５）Ｃ，相对 湿度３５％～５０％，培养时间１２０～１５０ｈ。
（２）种子培养条件 培养温度２７ Ｃ，２５０ｍｌ三角 瓶装量２５ｍｌ，转速２４０ｒ／ｒａｉｎ，培养时间２０～２４ｔｌ。
（３）发酵培养条件 培养温度２７ Ｃ，２５０ｍｌ三角 瓶装量２５ｍｌ，转速２４０ｒ／ｒａｉｎ，培养时间１２０ｈ。
分离或其他诱变处理，经不同模型选择的较优菌株）， 连续发酵三批，其结果平均值见表１。
由表１可以看出ＯＴ一３菌株ｌｉｐｓｔａｔｉｎ发酵效价较 高，因此选择ＯＴ一３为出发菌株。 ２．２ 紫外线诱变处理结果
试验中对出发菌株ＯＴ一３进行不同剂量的ＵＶ诱 变处理，经梯度稀释后涂布平板，待菌落生长成熟后， 从每个处理剂量平板中挑取３０个单菌落分别传斜面， 逐一接种发酵瓶，考察诱变株的发酵水平，统计其致死 率、变异率（±１０％以上）和正变率，所得结果见表２。
（２）摇瓶种子培养基（ｇ／Ｉ。） 冷榨黄豆饼粉１５．０， 甘油１５．０，酵母膏７．５，豆油５．０，ＫＮ０３ ２．０，ＭｇＳ０４· ７Ｈ：Ｏ １．０，自来水配制，ｐＨ７．Ｏ～７．２。
（３）发酵培养基（ｇ／Ｉ。） 冷榨黄豆饼粉３０．０，甘油 ２０．０，大豆卵磷脂１２．０，酵母粉１０．０，豆油５．５，自来 水配制，ｐＨ７．０～７．２。 １．３培养条件
ｓｔａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｈｅｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ
［Ｊ］．Ｄｉａｂ ｏ ７ｆ。１ ９９８，２１（８）：１２８８ ［４］周德庆著．微生物教程［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１ ９９８ ［５］Ｍａｒｋｕｓ Ｇ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｅ．Ａｄｅｌｂｅｒｔ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
由表３可以看出，随着微波照射时间的延长致死 率上升，正变率下降，但产量最大提高率随时间延长而 上升，故后续试验采取微波照射７ｒａｉｎ。
以ＯＴ一６３为出发菌株，进行微波诱变，微波处理 后的孢子悬浮液经适当稀释后涂布于分离平板，待菌 落成熟后，挑单菌落传斜面，进行摇瓶发酵初筛和复 筛。得到高产菌株ｗ一３９，总发酵效价和胞外发酵效价 均高于菌株ＯＴ一６３，结果见图１、图２。
表４ 不同浓度豆油对ｌｉｐｓｔａｔｉｎ产生菌生长的影响
经过５轮ＵＶ和微波交替处理，高浓度豆油平板 选择，得到菌株ＸＣ—ｌｐ一６９发酵效价达９１１弘ｇ／ｍｌ，较原 始菌株ＸＣ—ｌｐ一２（３００＞ｇ／ｍ１）提高了２倍多。推测这种 诱变和筛选方法有助于提高菌体的脂肪酶的合成能力 或活性，或提高脂肪酶的分泌速度，增加ｌｉｐｓｔａｔｉｎ合成 所需前体浓度，提高ｌｉｐｓｔａｔｉｎ的效价。 ２．５高产菌株ＸＣ—ｌｐ一６９的稳定性考察
＋＋＋：长得好； ＋＋：长得一般； ＋：长得差； ～：几乎不长。 ４０
一 琶 ３０
暴 惫２０ ： 牲 通ｌＯ
０ ７０
９０
１１０
１３０
１５０
荆ｌＸ，Ｊ效价（％）
圈３
耐豆油变株产量分布图［耐受剂量１．５％（Ｖ／Ｖ）］
万方数据
参考文献 ［１］Ｗｅｎｄｙ Ｍ，Ｐａｕｌ Ｂ．Ｏｌｉｓｔａｔａｔ口］．Ｄｒｕｇｓ，１９９８，５６（２）：２４１ ［２３ Ｍｅｌｉａ Ａ Ｔ，Ｚｈｉ Ｊ，Ｚｅ ｌａｓｋｏ Ｒ，ｅｌ ａ１．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
油突变株，获得了高产突变株ＸＣ—ｌｐ一６９，其ｌｉｐｓｔａｔｉｎ发酵效价达到９１ｌｐｇ／ｍｌ，较出发菌株ＯＴ一３提高了７１．６％。传代试验表明突变
株ＸＣ—ｌｐ一６９的高产遗传特性稳定。
关键词：Ｌｉｐｓｔａｔｉｎ； 菌种选育； 诱变； 毒三素链霉菌
中围分类号：ＴＱ４６５
文献标识码：Ａ
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｌｉｐｓｔａｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ
由表２可知，随紫外线照射时间的延长，致死率、 变异率相应增加，但正变率较高出现在偏低剂量 ．（６０ｓ），这与有关报道［４］一致，故后续试验中均采用 ＵＶ照射６０ｓ。经多次ＵＶ诱变选得菌株ＯＴ一６３，较出 发菌株ＯＴ一３效价提高２０％，达到６３６９９／ｍｌ。 ２．３微波诱变处理结果
试验中对出发菌株进行了不同时间的微波照射处 理，稀释涂平板，待菌落成熟后转接斜面，摇瓶发酵考 察。统计致死率、正突变率和产量的最大提高率，结果 见表３。
中国抗生索杂志２００７年８月第３２卷第８期
·４５９·
文章编号：１００１—８６８９（２００７）０８—０４５９—０３
Ｌｉｐｓｔａｔｉｎ高产菌株筛选
韩俊茹 陈锡永 （浙江医药股份有限公司新昌制药厂， 新昌３１２５００）
摘要： 以毒三素链霉菌ＸＣ—ｌｐ一２的变株ＯＴ一３为出发菌株，经ＵＶ和微波复合诱变处理，并在含豆油的平板上定向筛选耐豆
§６０ 一 墨 皇ｄＯ 叁 裁 越２０ 蜊
０
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１６０
时问（ｈ）
１：对照０Ｔ一６３；２：Ｗ一３９
图２
菌株ｗ一３９和ＯＴ一６３分泌ｌｉｐｓｔａｔｉｎ至胞外
比例的比较
生物合成途径的反馈调节作用，促进ｌｉｐｓｔａｔｉｎ的合成。 ２．４耐豆油突变株筛选
文献报道，豆油为ｌｉｐｓｔａｔｉｎ的合成提供前体［５“］。 通过选育耐豆油突变株，能充分利用培养基中的豆油 合成大量前体物质参与ｌｉｐｓｔａｔｉｎ的生物合成，大幅度 提高产量。以ＯＴ一６３的单孢子悬浮液经适当稀释后， 涂布于含不同浓度豆油的分离平板上，培养观察，结果 如表４。
ｔｈｅ ｌｉｐｏｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｒｌｉｓｔａｔ ｗｉｔｈ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎ—
ｔｅｅｒｓ口］．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。１９９８，５４（９～１０）：７７３ ［３］Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ Ｐ Ａ，Ｅｌｂｅｉｎ Ｓ Ｃ，Ｈｉｒｓｃｈ Ｉ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｏｒｌｉ—
将经过ＵＶ照射、微波处理或两者交替处理后得 到的孢子悬液梯度稀释后，分别涂布于含一定豆油浓 度的分离平板上，３０℃培养。 １．６分析方法
（１）Ｉ．ｉｐｓｔａｔｉｎ发酵效价测定 试样制备 取发酵液１０ｍｌ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心 １５ｍｉｎ，上清液用丙酮１：４的比例稀释摇匀浸泡１ｈ， 取上清液再次１００００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ或膜过滤，取清 液进行ＨＰＩ。Ｃ测定胞外效价，并用同样的方法测定菌 丝体沉淀中的产物量（胞内效价）。本文中发酵效价为 胞内外效价之和。 ＨＰＩ。Ｃ色谱条件 色谱柱Ｃ，。ＯＤＳ（４．６ｍｍ× ２５０ｍｍ，５肛ｍ），柱温３５‘Ｃ，检测器ＤＡＤ（ＨＰｌｌ００），检 测波长２１０ｎｍ，流动相为乙腈：水（８６：１４），流速 ０．８ｍｌ／ｍｉｎ。 （２）ｐＨ测定用酸度计测定。 （３）菌丝浓度测定 取１０ｍｌ发酵液，４０００ｒ／ｍｉｎ 离心１５ｍｉｎ，测定沉淀物在发酵液中所占比例作为菌 丝浓度。 ２结果与讨论 ２．１ 出发菌株的选择 取４＋Ｃ冰箱保存的１０株菌（ＸＣ—Ｉｐ一２经多次自然
ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ Ｉ。ｉｐｓｔａｔｉｎ； Ｓｔｒａｉｎ ｂｒｅｅｄｉｎｇ； Ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ； Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｏｘｙｔｒｉｃｉｎｉ
Ｌｉｐｓｔａｔｉｎ（利普司他汀）是毒三素链霉菌（Ｓｔｒｅｔｏ— ｒｎｙｃｅｓ ｔｏｘｙｔｒｉｃｉｎｉ）的代谢产物，能选择性抑制胃肠道中 胰脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收，其四氢衍生 物奥利司他（ｏｒｌｉｓｔａｔ）已被Ｒｏｃｈｅ公司开发为减肥药 （商品名：赛尼可，Ｘｅｎｉｃａｌ）［１．ｚ３，是目前唯一一个作为 非中枢神经系统作用上市的治疗肥胖症的药物［３］。因 此，发酵法生产ｌｉｐｓｔａｔｉｎ备受关注。
Ｈａｎ Ｊｕｎ—ｒｕ ａｎｄ Ｃｈｅｎ Ｘｉ—ｙｏｎｇ （Ｘｉｎｃｈａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆａｃｔｏｒｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．，Ｘｉｎｃｈａｎｇ ３１２５００）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ａｆｔｅｒ Ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｅｓ ｔｏｘｙｔｒｉｃｉｎｉ ＯＴ一３ ｗａｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ＵＶ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｏｙ— ｂｅａｎ ｏｉｌ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ａ ｈｉｇｈ—ｔｉｔｒｅ ｓｔｒａｉｎ ＸＣ—Ｉｐ一６９ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＸＣ—ｌｐ一６９ ｒｅａｃｈｅｄ ９１ １ ｔｌｇ／ｍｌ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ７１．６％ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔａｉｎ ＯＴ一３．Ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＸＣ—ｌｐ一６９ ｉｓ ｓｔａｂｌｅ．