重组质粒的转化(转菌)

重组质粒的转化
重组质粒的转化(热休克法)
本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2µl质粒即可）。

本流程以α-互补鉴定为例。

适用于含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。

不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:
1.IPTG溶液(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水
中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。

2.X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。

3.LB液体培养基（无抗生素）。

4.含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin
的LB培养板表面加入4µl 200mg/ml IPTG和16µl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。

（注意：4µl 200mg/ml IPTG 加上16µl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100µl左右。

）
5.感受态细胞。

6.42℃水浴。

7.冰浴。

㈡操作流程:
1.准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛选用平板，使用前将平板预热至室温。

2.从-80℃中取出冰冻的感受态细胞(如JM109)，臵冰浴中约5min至刚刚融化。

轻
轻晃动使细胞混匀，仍臵冰浴中。

3.离心连接反应管，吸取5~20µl连接体系至臵于冰上的感受态细胞中。

4.轻轻晃动使其混匀，臵冰上30min。

5.于准确调温的42℃水浴中热休克45~50sec，切勿摇晃、震动。

6.速回冰浴2min。

7.加入800µl已经预热到室温的无抗生素的LB液体培养基。

8.摇菌:37℃×200rpm×1.5~2 h。

9.铺板:将100µl转化体系均匀涂布于准备好的LB/amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛
选用平板（可将1ml全部铺板）。

10.液体被吸收后倒臵培养37℃×过夜。

11.蓝白斑鉴定：臵4℃下1~4h使蓝色充分显现，以便蓝白斑鉴定。

白色菌落为带有
重组质粒的克隆。

非α-互补鉴定的话，没有蓝白斑鉴定这步，过夜培养所产生菌
落即为可能带有重组质粒的克隆。

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2µl质粒即可）。

原理：新鲜培养的细菌细胞遇到高效致敏剂时，其细胞表面会形成微小的孔洞，有利于外源DNA分子进入细胞内，从而形成转化。

以下流程以博大泰克公司高效感受态细胞DH5α、BL21(DE3)、JM109等为例。

本流程以α-互补鉴定为例。

适用于含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。

不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:
1.IPTG溶液(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水
中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。

2.X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。

3.LB液体培养基（无抗生素）。

4.含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin
的LB培养板表面加入4µl 200mg/ml IPTG和16µl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。

（注意：4µl 200mg/ml IPTG 加上16µl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100µl左右。

）
5.致敏感受态细胞。

6.试剂A（随感受态细胞提供）。

7.无菌水（随感受态细胞提供，自制亦可）。

8.冰浴。

㈡操作流程:
1.准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛选用平板，使用前将平板预热至室温。

2.从-80℃中取出冰冻的感受态细胞（约80~100 µl），臵冰浴中约5min至刚刚融化。

轻轻晃动使细胞混匀，仍臵冰浴中。

3.离心连接反应管，吸取5~20µl连接体系至臵于冰上的一个无菌管中。

4.在管中加入试剂A 20µl，无菌水稀释至100 µl，混匀。

5.将以上混合液加入到感受态细胞中，轻轻晃动使其混匀。

6.冰浴20min。

7.室温放臵10 min。

8.加入400µl已经预热到室温的无抗生素的LB液体培养基。

9.摇菌:37℃×200rpm×1~1.5h。

10.铺板:将100~600µl转化体系均匀涂布于准备好的LB/amp/IPTG/X-Gal平板或者其
它筛选用平板（可将1ml全部铺板）。

11.液体被吸收后倒臵培养37℃×过夜。

12.蓝白斑鉴定：臵4℃下1~4h使蓝色充分显现，以便蓝白斑鉴定。

白色菌落为带有
重组质粒的克隆。

非α-互补鉴定的话，没有蓝白斑鉴定这步，过夜培养所产生菌
落即为可能带有重组质粒的克隆。

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2µl质粒即可）。

㈠试剂及材料:
1.LB液体培养基（无抗生素）。

2.适当的选择性LB培养板。

3.电转感受态细胞（制备方案见相关流程）。

4.电转化仪Mµltiporator®和电转杯。

5.冰浴。

㈡操作流程:
1.从-80℃中取出一管冻存的电转感受态细胞（40µl~300µl/管，根据拟使用的电转杯
容积而定，一般使用1mm电转杯，其最大容积100 µl，最少需40µl电转感受态细胞，可以使用更多的电转感受态细胞，但与连接体系或质粒混合后，不要超过电转杯最大体积），臵冰浴中约5min至刚刚融化。

2.离心连接反应管，吸取5~10µl连接体系加入到感受态细胞中，使用吸头轻轻吹打
几次使其混匀。

3.将以上混合液加入到预冷的电转杯中，小心除去气泡，将电转杯插入电转仪。

4.电转化（电转参数可参考表19）。

5.立即加入无抗生素的LB液体培养基1ml，轻轻混匀，将以上混合液转入一个无
菌的培养管中。

6.摇菌:37℃×200rpm×0.5~1h。

7.铺板:将适当量的转化体系均匀涂布于预温到室温的选择性LB培养板上。

8.液体被吸收后倒臵培养37℃×过夜。

表格21、电转参数参考。