纤维素酶产生菌的筛选

纤维素酶产生菌的筛选
实验原理
纤维素酶是指能水解纤维素β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维素二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系，纤维素酶主要是由：C1酶（外切β-1，4葡聚糖酶）、Cx（内切β-1，4葡聚糖酶）和BG（β-1，4葡萄糖苷酶）组成[11]。

不同微生物合成纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的酶能力也大不相同。

对纤维素能进行有效降解的生物包括细菌、丝状真菌、放线菌、软体动物等. 森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长. 实验步骤
1.样品的采集
在学校森林富含有机质的土壤中用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好.
2.富集培养
在培养基中加入纤维素作为唯一的碳源，那些能分解利用的菌株因能得到充分的养分而迅速增殖，而其他微生物由于不能分解利用这些物质，生长受到抑制。

培养基的制备：磷酸二氯钠0.1%,硫酸镁0.05%，硫酸铵1.5%，纤维素粉4%，PH值5.8~5.9，按比例制配培养基。

在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20m in。

富集培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。

将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。

3.菌种的分离
制备菌悬液：富集培养后，吸取上述培养基0.1mL稀释至10-4，10-5，10-6 。

维素-刚果红培养基的制备：硫酸铵2g，硫酸镁0.5g,磷酸氢鉀，氯化钠0.5g纤维素粉2g,刚果红0.4g琼脂22g水100ml。

在500mL三角瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。

涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30℃倒置培养，至菌落长出。

每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照，
4.菌种初筛和复筛
用接种环从平板中的单个菌落上挑取一些接种到平板筛选培养基上培养。

进行测定透明圈直径（d）与菌落直径（D）之比（d/D），以此比值来衡量纤维素酶产生能力的大小，从而进行纤维素酶产生菌的初筛。

将初筛出的菌株接入液体培养基中，摇瓶培养。

进一步进行复筛，选最优的纤维素酶产生菌。

参考文献
[1]陈洪章.纤维素生物技术[M].北京：化学工业出版社
[2]高洁，汤烈贵.纤维素科学[M]北京：科学出版社，
[4]黄秀梨.微生物学实验指导[M]北京：高等教育出版社
[7]周德庆.微生物实验手册[M]上海：上海科学技术出版社
09级生本一班0901410112 周利。