分析化学-分子发光分析法

3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
（1）化学发光免疫分析系统 以吖啶酯为发光标记物，采用化学发
光技术与磁性微粒子分离技术相结合的 分析系统。
分析过程： 抗原抗体反应：
氨基酸氧化酶
氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2
葡萄糖氧化酶
葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。
2.其他化学发光体系 咪唑类：
洛酚碱（2，4，5-三苯基咪唑） 吖啶盐类：
光泽精（N，N二甲基吖啶硝酸盐） 草酸盐类：双-（2，4，6-三氯苯基）草酸盐
第五章 分子发光分析法
分子发光
物质分子吸收一定能量后，电子能级由基 态跃迁到激发态，当其返回基态时，以光辐 射的形式释放能量。这种现象称为分子发光。
分子发光
• 光致发光：分子通过吸收光能被激发。 • 化学（生物）发光：分子吸收化学反
应（生物体内的化学反应）释放的能 量被激发。
分子发光分析法
基于分子发光现象进行分析的方法称 为分子发光分析法。
偶合化学发光 A 十 B C ， C +D E 十 F＊
F＊ F 十 hν
常用的化学发光体系
1.鲁米诺发光体系
鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼） 异鲁咪诺（4-氨基苯二甲酰肼）
化学发光反应效率：0.15～0. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：
（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用 这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+ 、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 （2） 间接测定某些生物试样m) 278
321
404
Φ 0.11
0.29
0.36
2) 刚性平面结构
O-
O
OO
Fluorescein
COO-
O
COO- Phenothalin
Φ 1.0
0.20
3) 取代基效应
●给电子（斥电子）取代基 F↑
-NH2; -NR2; -OH; -OCH3
Mono –
cell
chromator 2 Detector Indicator
light source:
Pressure mercury vapor lamp (254nm; 365nm; 405nm; 436nm; 546nm) Xenon lamp: (250 ~ 700nm)
Monochromator 荧 光 计：滤 光 片 荧光分光光度计：石英棱镜、光栅
上述物质被氧化时（常用H2O2作为氧化剂）， 产生化学发光。
三、化学发光 测量仪器
1.化学发光仪示意图
发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器 中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重 复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入 混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度 ；试样量大；
1. 无机化合物的分析 1) 形成荧光螯合物的直接分析法 2）被测物作为荧光熄灭剂的荧光
熄灭分析法
2. 有机化合物的分析
1）芳香族及具有芳香结构的化合物 苯并（a) 芘 黄曲霉素 维生素类 某些氨基酸、蛋白质
2）还原型辅酶I（NADH） 还原型辅酶II（NADPH）
λex = 340 nm λex = 460 nm
3. 荧光标记技术在生物医学研究中的应用
常用的荧光试剂(探针): 1) 溴化乙锭 EB λex / λem 482 nm / 616nm 2) 异硫氰酸荧光黄FITC λex / λem 490 nm / 520 nm 3)四甲基异硫氰罗丹明 TR ITC
λex / λem 550nm / 620nm
●吸电子取代基
F↓
-NO2; -C=O; -COOH)
NH2
OH
NO2
四、荧光强度与浓度之间的关系
F K' (I0 It ) It I010 ε bc F K' I0 (1 10 ε bc ) K' I0 (1 e2.303εb c )
F K ' I0[2.303 bc (2.303 bc)2 / 2! (2.303 bc)3 / 3! ]
absorption fluorescence phosphorescence
第一电子单线激发态的最底振动能级
fluorescence
单线基态各振动能级 第一电子三线激发态的最底振动能级
phosphorescence
单线基态各振动能级
二、激发光谱与荧光光谱
F 荧光波长407nm
386
366
F
激发光波长386nm 407
(3)微粒子酶放大化学发光免疫分析系统 以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以磁性
微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发 光剂。
分析过程： 抗原抗体反应： 抗体包被的磁珠+待测抗原+标记抗体 洗涤、分离 加入AMPPD 信号检测
(4) 电化学发光免疫分析系统 以三联吡啶钌标记抗原或抗体，以三丙
胺（TPA）为电子供体，磁性微粒子为 固相载体，利用电化学反应产生化学发 光。
分子发光分析法
分子荧光分析法 化学发光分析法
方 灵敏度高 法 选择性高 特 试样用量小 点 线性范围宽
§ 1 分子荧光分析法原理
荧光fluorescence：当有些物质受到光照射时， 会发射出比原来吸收波长稍长的光；当光照射 停止时，这种光线也随即消失，这种光称为荧 光。
荧光分析法：通过测定分子所发射荧光的特征 和强度，对物质进行定性、定量分析的方法。
Absorption cell 石英比色皿
Detector 光电倍增管 光电二极管阵列检测器
§ 3 荧光分析法的应用
一、定性分析Qualitative analysis 二、定量分析 Quantitative analysis
参比溶液的荧光强度F0，样品溶液荧光强度F F – F0 = Kc
定量方法: 标准曲线法 直接比较法
430
453 347
350 375 400
激发光谱
400 430 460
荧光光谱
菲 E: 激发光谱；F: 荧光光谱；P: 磷光光谱
三、荧光与分子结构的关系
1. 荧光量子效率Φ Fluorescence quantum of efficiency
发射荧光的量子数 f 吸收激发光的量子数
2. 荧光与有机化合物结构的关系 1) 共轭结构
5. Scattering light
1) Rayleigh scattering light 2) Ramam scattering light
INTERFERENCE OF SCATTERING LIGHT
§ 2 荧光分析仪器
light source
Mono – chromator 1
absorption
四、 化学发光分析法的应用
(一) 气体分析 (二) 液相分析 (三) 内分泌激素的测定 肿瘤标志物的测定 病毒标志物的测定 心血管疾病标志物的测定 治疗药物浓度的检测
当εbc≤0.05时， F = K’I02.303bc
F = K’c
若εbc＞0.05，则后几项不能忽略，
荧光强度与荧光物质浓度也就不是 简单线形关系。
五、影响荧光强度的因素
1. Solvent : polarity F, IF 2. PH 3. Temperature: T, IF 4. Quenching agent
根据化学发光强度测定物质含量的方法称为 化学发光分析法。
特点： 灵敏度高，线性范围宽，仪器简单。
1.化学发光的条件
反应必须是自发的且释放的能量足以使基 态分子转化为激发态分子
必须有利于形成激发态的反应历程 激发态分子以光子发射的方式去激发
化学发光反应多为氧化还原反应，激
发能与反应能相当, E=160～42
energy
一、分子荧光的产生
1 分子激发态
A.Singlet ground state B. Singlet excited state C. Triplet excited state D. Double state
A BCD
2. 荧光的产生 S2 v0
S1 v0
v4 T1
v0
v4
v2
S0
v0
抗体包被的磁珠+待测抗原+标记抗体 洗涤、分离 加入氧化剂发光 信号检测
(2) 化学发光酶联免疫分析系统 以过氧化物酶标记抗原或抗体， 以
H2O2-鲁咪诺为化学发光体系，采用化学 发光增强试剂使化学发光强度增加、发光 时间延长。
分析过程： 抗原抗体反应： 抗体包被的固相载体+待测抗原+标记抗体 洗涤、分离 加入化学发光体系 信号检测
0kJ/mol, 化学发光波长处于可见光区。
2. 化学发光强度与反应物浓度的关系
Icl(t) cl dc
dt Icl(t)为时间t时的发光强度（光子/ 秒）
dc / dt为反应速度（分子数/ 秒）
cl为发光量子效率，cl
发出光子数 反应分子数
在将反应物混合后，由于化学发光 物母体的不断消耗，化学发光强度将随 反应时间而衰减，化学发光强度随反应 物混合时间变化的关系曲线如图所示。