30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备汇编

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CN 201110417088 请

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2013年6月19日开

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申

请

2011年12月14日日

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优

2011年12月14日先

权

日

公开号201110417088.3, CN 103163226 A, CN 103163226A, CN 201110417088, CN-A-103163226, CN103163226

A, CN103163226A, CN201110417088, CN201110417088.3

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明

者

刘丽宏, 李鹏飞, 李丹, 张绪得, 陶蓓蓓

申

请

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刘丽宏, 李鹏飞, 李丹

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被以下专利引用(4), 分类(2), 法律事件(3)

外部链接: 中国国家知识产权局, 欧洲专利数据库 (Espacenet)

30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备

CN 103163226 A

摘要

本发明提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒及其制备方法。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇衍生化处理，吹干复溶后，采用C18键合相硅胶为固定相，以含七氟丁酸和甲酸的乙腈水为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测。本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到10ng/ml，各项方法学指标均可满足氨基酸临床检验、工业生产和科学研究等定量需要。

权利要求(8)

1.一种高灵敏30种氨基酸同时定量检测试剂盒，其特征在于由特定浓度的稳定同位素内标样本、质控样本、衍生化试剂、流动相调节液组成。

2.根据权利I所述的30种氨基酸同时定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤:(1)稳定同位素内标冻干粉的制备；(2)质控样本的配制；(3)衍生化试剂的制备；(4)流动相调节液的配制。

3.—种30种氨基酸同时定量检测方法，包括: (1)浓缩储备液和日常工作液的配制: 取“稳定同位素内标冻干粉”用有机溶剂充分溶解，混匀，即为浓缩储备液，使用效期I个月；浓缩储备液用有机溶剂稀释适宜倍数，即为日常工作液，使用效期I周。(2)样本预处理: 取一定量的样本，加入日常工作液，涡流，高速离心取上清液，吹干或冻干或挥干，加入适量的衍生化试剂衍生化一定时间，吹干或冻干或挥干，加入复溶液复溶。(2)液相分离: a.采用C18、C8或氰基键和硅胶作固定相；b.流动相:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸铵；甲酸铵；二乙胺•’三乙胺；等度或梯度洗脱；控制流速。(3)质谱测定:电喷雾离子源；大气压化学电离源；正离子方式。

4.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于同时定量检测30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、Y-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)中的一种或多种，包含且不限于此30种氨基酸。

5.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用乙腈、甲醇、三氯醋酸或高氯酸等蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀。

6.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用盐酸正丁醇进行衍生化处理。

7.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于用稳定同位素内标进行定量检测。

8.根据权利3所述的30种氨基酸同时定量检测方法，其特征在于其所使用的流动相为:甲醇；乙腈；乙酸；甲酸；三氟乙酸；七氟丁酸；乙酸铵；甲酸铵；二乙胺；三乙胺；反相色谱等度或梯度分离。

说明

30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备

所属技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)开发的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，更具体地说是采用液相色谱-串联质谱技术对样本中30种氨基酸进行高灵敏度定量检测的方法。[0002] 本发明还涉及本发明试剂盒的生产方法和应用。

背景技术

[0003] 氨基酸(Amino acid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。自然界中已发现的氨基酸有180多种，人体内重要的氨基酸有30多种。生命的产生、存在和消亡，无一不与蛋白质有关，而氨基酸正是蛋白质的基本单位，所以如果人体氨基酸发生变化，不在正常值范围

内，就会导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，最后导致疾病。目前氨基酸代谢障碍所引起的疾病已超过400多种，涉及代谢、肿瘤、免疫、心脑血管、神经系统、肾病、糖尿病、亚健康、老年病等各类疾病和人体生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等各个健康环节。

[0004] 氨基酸在医药上也有广泛应用。目前用作药物的氨基酸有一百几十种，其中包括构成蛋白质的氨基酸有20种和构成非蛋白质的氨基酸有100多种。因此，检测复杂样本中氣基酸的含量对临床检验、工业生广和科学研究等都具有重要意义。

[0005] 1958年Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后却三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，新的氨基酸分析方法不断涌现，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、液相色谱法等相继应用于氨基酸分析。传统的氨基酸分析技术已很难满足极微量氨基酸的准确和高通量检测需求。

[0006] 液相色谱-串联质谱技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，样本在液相色谱质谱部分分别被分离及离子化，经检测器得到质谱图，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单和自动化程度高的特点，日渐成为体内外定性和定量分析的实用方法。研究开发一种结果准确、严格区分同分异构体、分析通量高、价格低廉、操作简便、易于推广的30种氨基酸LC-MS/MS同时定量检测试剂盒，使其能广泛应用于