2010版药典微生物限度检查及验证
(附录4)2010版CHP_微生物限度检查法应用指导原则
微生物限度检查法应用指导原则为更好应用微生物限度检查法（附录ⅪJ），特制定本指导原则。
微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。
1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 微生物限度检查法（附录ⅪJ）收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试液，规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。
采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收， 易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。
因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。
4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查。
由中国药品生物制品检定所研制及分发。
5. 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1：10-3。
4中国药典2010年版微生物限度检查及发展趋势J
无具体规定
平皿法、MPN
大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单 胞菌、金葡球菌、大肠菌群、肠 道菌、肠杆菌科
无具体规定
平皿法、薄膜过滤法、MPN
大肠埃希菌、沙门菌(10)、 铜绿假单胞菌、金葡球菌； 肠杆菌科及某些革兰阴性菌
稀释液 培养条件与时间
控制菌检查结果 判断与复试规定 计数结果判断与 复试规定
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液； pH7.2PBS；大豆酪蛋白消化培养
4中国药典2010年版微生物限度检查及发展趋势J
无菌/微生物限度检查理念
环境保证
培养基保证
无菌性检查 灵敏度检查
SOP操作
有效的方法
方法验证
有效的结果 可靠的结论
结果判断
中国药品生物制品检定所
2
微生物限度检查现状
1、方法和标准的修订与完善 2、技术现状与标准化 3、微生物限度检查的几个问题 4、微生物限度检查法应用指导原则（逐条解读）
中国药品生物制品检定所
5
1、方法和标准的修订与完善
对供试品的前处理和一些检验方法进行了完善；
具有明显的中国特色，与国际差距显著。
计数测定体系的差异：
难以操作，检验繁琐
需气菌总数=细菌数+霉菌及酵母菌？
1000
1000 100
参见：《美英欧药典微生物限度标准的浅析》，苏德模、胡昌 勤、马越，《中国药品标准》，2005年第3期
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液； 乳糖肉汤/其他培养基
需气菌总数：大豆酪蛋白消 化物琼脂，5天 霉菌及酵母：含抗生素的沙 氏葡萄糖琼脂、大豆酪蛋白 消化物琼脂，5天
《中国药典》微生物检查法
中国药典2010年版框架(卫)
• 无菌检查法 • 微生物限度检查法 • 灭菌法
• 抑菌效力检查法指导原则 • 药品微生物检验替代方法验证指导原则 • 微生物限度检查法应用指导原则 • 药品微生物实验室规范指导原则
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2010年版微生物限度检查法修订
2010年版《中国药典》微生物限度检查法 附录XIII C（一部） 附录XI J （二部）
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2010年版微生物限度检查法修订
2、附录107页，检验量 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；
（中药）膜剂为（50）100cm2；贵重药品、微 量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门 菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中 10g或10ml用于阳性对照试验 ）。
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2010年版微生物限度检查法修订
可选用的中和剂或灭活方法 亚硫酸氢纳 稀释剂 稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐 卵磷脂、聚山梨醇酯 亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 卵磷脂 聚山梨醇酯 硫代硫酸盐 镁或钙离子 对氨基苯甲酸 ß-内酰胺酶
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2010年版微生物限度检查法修订
8、附录109页，增加： • 若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物
4、附录108页，新增：贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃 或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如 无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或 卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他 方法制备成供试液。
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2010年版微生物限度检查法修订
11、附录109页，修订：菌数报告规则 • 细菌、酵母菌宜选取（细菌、酵母菌平均菌落数在30～
微生物限度验证方案
微生物限度验证方案编制：日期：审核：日期：批准：日期：文件编号：文件版本：文件受控：验证方案：一．验证目的：确认供试品所采用的检查方法和检查条件下无抑菌作用，以保证微生物的充分检出，确保检验方法科学性、检验结果准确性。
二．.验证依据：GB/T14233.2—2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法《中国药典》2010版三．.验证频次：检验条件发生改变时、检验方法发生改变时、检验人员发生改变时、进行再验证，如果一切都没发生改变时一年进行一次。
四．职责：4.1生产技术科制定验证方案。
4.2质管科按照验证方案执行。
五．.验证小组成员：六．实施日期：七.资料保存：由质管科保存5年。
八．检验方法：计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。
菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代）。
试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念球菌黑曲霉菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18~24小时：接种白色念球菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24~48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，加入3~5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。
菌悬液再室温下放置应在2小时内使用，若保存再2~8℃可再24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存期内使用。
适应性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50~100cfu,分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23~28℃培养72小时，计数。
2010中国药典二部附录XI-J
中国药典2010年版二部附录XI J微生物限度检查法微生物限度检査法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检査法中细菌及控制菌培养温度为30〜35°C;霉菌、酵母菌培养温度为23〜28°C，检验结果以lg、lml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2»贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验）。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1. 液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加人适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2. 固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g ，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。
微生物限度检查方法验证方案
微生物实验室检测设备配置方案微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。
3.规范性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。
4.验证实施：4.1.1试验前的准备：4.1.1.1试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃,灭菌30 min,在3天内使用。
4.1.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制微生物实验室检测设备配置方案说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃, 灭菌15 min，在3周内使用。
4.1.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。
版中国药典微生物限度检查方法验证方案
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案下表用于记录修订/变更主要内容及历史..目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊;产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查..参照中国药典2015版四部附录1105：微生物计数法;以及1106：控制菌检查法的规定;本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证..通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用..人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分;文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性;对霉菌和酵母菌无抑菌活性..甲硝唑在水中微溶;可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响..本验证方案通过试验菌株的回收率测试;首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用;则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查..本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件;按制定的方法进行试验;根据验证结果判断是否符合验证标准..2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性;对其有效性进行评价;保证检验结果的可靠性..本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊;进行微生物限度检查方法的验证..3.组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草;由质量部审核;最终由质量负责人批准..验证方案实施完成后;由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告;由质量部审核;最终由质量负责人批准报告..3.2验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后;;由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作;并将该次的培训记录归档..3.3验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差;质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施..3.4 验证工作小组成员表4. 验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月..5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认5.1.主要检验仪器设备确认表检查人/日期：复核人/日期：5.2.验证所需文件的确认表检查人/日期：复核人/日期：6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1.试验菌种检查表检查人/日期：复核人/日期：6.2试验所需的培养基检查检查人/日期：复核人/日期：6.3.检验样品确认表检查人/日期：复核人/日期：7.验证项目和验证方法7.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌..试验菌株的传代次数不得超过5代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中;30～35℃培养18～24小时;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中;20～25℃培养2～3天;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上;20～25℃培养5～7天;直到获得丰富的孢子..加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液;将孢子洗脱;吸至无菌试管中;取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/m的孢子悬液备用..菌液制备后若在室温下放置;应在2 小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃ ;在验证过的贮存期内使用..验证时;对各试验菌的回收率逐一进行验证..7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.3.1.供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液..7.3.2.试验组取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..取1：10的供试液1ml注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养5天;点计菌落数..另取1：10的供试液1ml注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀;平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 2 范围内..常规倾注平皿法方法验证的结果常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验;若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内;则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查..如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查;但不适用于需氧菌总数检查;则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查..7.4. 需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1.供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液贮备液..取1:10的供试液贮备液50ml;经500转/分钟离心3分钟;取上清液得供试液..7.4.2.试验组取供试液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次;然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu 的试验菌;过滤..每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..7.4.3.供试品对照组取供试液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次;平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养5天;点计菌落数..7.4.4.菌液对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;200ml通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;过滤..每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..稀释剂对照组依照7.2项下菌液制备方法;以0.9%无菌氯化钠为稀释液;将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次;每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..7.4.6. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 2 范围内;同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0 .5 2 范围内..7.4.7.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：7.4.8. 离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内;稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数..7.5.控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法若在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法的试验中;证实了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性;不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查;则为了确保控制菌检查的可靠性;采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行控制菌检查;按照以下方案进行方法学验证..7.5.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌;所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证..试验菌株的传代次数不得超过5代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..7.5.2 控制菌检查方法验证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中;30～35℃培养18～24小时;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..菌液制备后若在室温下放置;应在2 小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..验证时;对各试验菌的回收率逐一进行验证..7.5.3大肠埃希菌检查方法验证供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液贮备液..取1:10的供试液贮备液50ml;经500转/分钟离心4分钟;取上清液得供试液..取供试液10ml;加至100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次;然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入～100cfu的大肠埃希菌;过滤..取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中;42～44℃培养24～48小时..取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～72小时..麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长..组～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次..取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中;42～44℃培养24～48小时..取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～72小时..麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长..取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..阴性对照应无菌生长..试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：大肠埃希菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌;阴性对照组无菌生长;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查..菌检查方法验证7.5.4.1供试液的制备取样品10g加0.9%无菌氯化钠溶液至100 ml制成1:10的供试液..取全部供试液经500转/分钟离心4分钟;取全部上清液为供试液..7.5.4.2.试验组取全部供试液;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次..然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入～100cfu的乙型副伤寒沙门菌;过滤..取膜接种至200ml 胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基;30～35℃培养18～24小时..取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～48小时..沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好;菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色..用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落;于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种;培养18～24小时.. 7.5.4.3阳性对照组～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次..取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基;30～35℃培养18～24小时..取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～48小时..沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好;菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色..用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落;于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种;培养18～24小时..7.5.4.4阴性对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..阴性对照应无菌生长..7.5.4.5离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：7.5.4.6乙型副伤寒沙门菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组与阳性对照组均检出典型乙型副伤寒沙门菌;阴性对照组无菌生长;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的乙型副伤寒沙门菌检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及乙型副伤寒沙门菌检查方法进行检查..8.偏差与漏项控制：微生物限度检查方法验证过程中存在和发现的任何偏差与漏项;都应进行详细的记录;并应按公司GMP文件偏差处理规程进行调查与处理..偏差调查与处理的报告和支持文件;应作为此确认方案的附录部分..检查人/日期：复核人/日期：9.验证报告会审验证报告会审表。
制药用水系统微生物检测和验证
细菌性热原污染
热原是指可能致热的微生物的代谢产物 外源性和内源性污染都可能导致热原污染 革兰氏阴性杆菌存在于细胞壁外壁层上的内毒 素－磷脂多糖与蛋白质的复合物－是热原反应 的主要因素
水系统微生物控制的手段
杀灭
物理消毒法
热消毒法（巴氏消毒，蒸汽灭菌），紫外辐照 化学消毒法 一般采用氧化剂 次氯酸钠，二氧化氯 臭氧，过氧化氢，高锰酸钾，过氧乙酸
储罐 水泵 热交换器 管道 阀门 接口
制药用水的质量构成
化学：
纯化阶段决定
微生物：
更注重从设计到运行和监测的整个过程
水系统微生物污染的来源
原料水 外源性污染 内源性污染
外源性污染
外源性污染主要指来自于水系统外部的原 因对系统造成的污染，例如：
系统未与外界空气隔绝
中国、美国和欧盟药典纯化水、注射用水部分指标
1、纯化水
中国药典
微生物＜100cfu/ml ……
美国药典
内毒素不控制 总有机碳： （TOC）＜0.5mg/l 微生物＜100cfu/ml 电导率＜1.3μs/cm
欧洲药典
内毒素＜0.25EU/ml 总有机碳: 同美国
微生物: 同美国 电导率 ＜1.3μs/cm
制药用水系统 微生物检测和验证
本次培训的目的
制药用工艺用水
定义? 用途? GMP的要求?
水系统基本构造 水系统微生物污染的来源及控制 水系统验证
制药用水的定义
Water is the most widely used substances, raw material, or ingredient in the production, processing, and formulation of compendial articles. (USP General Information section 1231)
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程1 目的与适用范围本规程规定了微生物限度检查方法和操作要求。
本规程适用公司所需进行微生物限度的检查。
2 职责质量保证部负责本规程的实施。
3 内容3.1 引用标准：《中国药典》2010年版二部。
3.2 药品微生物限度检查法总则3.2.1 抽样3.2.1.1 供试品一般按批号随机抽样。
3.2.1.2 一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
3.2.1.3 抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。
3.2.2 供试品保存供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。
3.2.2.2 供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。
3.2.3 检验3.2.3.1 供试品检验项目按《中国药典》2010年版二部微生物限度标准确定。
3.2.3.2 检验的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。
3.2.3.3 除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样。
3.2.3.4 制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。
3.2.4 培养3.2.4.1 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。
3.2.5 复检3.2.5.1 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。
3.2.5.2 复试项目以不合格项目为准，作单项复试。
3.2.5.3 复试需另取同批号样品，复试2次。
3.2.5.4 复试报告，以3次测定结果的平均值报告。
3.2.6 检验报告3.2.6.1 检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。
3.2.6.2 测定菌数报告，依3.10.2.4菌数报告规则报告。
2010年版《药典》微生物限度标准
《中国药典》2010年版二部附录XI J （附录115页）《微生物限度检查法》微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。
药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。
2.口服给药制剂细菌数每1g不得过l000CFU 。
每lml 不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每lg或lml 不得过100CFU 。
大肠埃希菌每1g 或lml不得检出.3 ．局部给药制剂3.1用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3.2 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过100CPU 。
霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过10CPU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。
大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、lml 或l0cm2，不得检出。
3.3 阴道、尿道给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2，不得过100CFU 。
霉菌数和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2应小于10CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、lml 或l0cm2，不得检出。
3 .4 直肠给药制剂细菌数每1g不得过l000CFU。
每lml 不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每1g 或lml 不得过100CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每lg 或lml 不得检出。
3.5 其他局部给药制剂细菌数每1g、lml 或l0cm2不得过100CFU 。
霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2不得过100CFU 。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。
4.含动物组织（包括提取物）的口服给药制剂每10g 或10ml 还不得检出沙门菌。
无菌微生物限度检查及方法验证.ppt
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
微生物限度标准2010版
二、微生物限度标准（2010版药典二部附录P115，一部P88）（一）致病菌•口服制剂每g或每ml不得检出大肠埃希菌，含动物药及脏器的药品同时不得检出沙门菌•含中药原生药粉还不得检出大肠菌群（大肠杆菌）•外用每g或每ml不得检出铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）、金黄色葡萄球菌；梭菌；大肠埃希菌（眼、鼻、呼吸）•阴道、创伤、溃疡用制剂同时不得检出破伤风杆菌。
一次为准，检出以不合格处理（二）活螨不得检出（三）细菌与霉菌1、要求无菌或标示无菌的制剂：应符合无菌检查规定3、局部给药制剂1）用于手术、烧伤或严重创伤的：应符合无菌检查规定2）用于表皮或粘膜不完整、含药材原粉的：•细菌数：≤1000 cfu /g或10cm2，≤100 cfu /ml•霉菌和酵母菌数：≤100 cfu /g、ml或10cm2•金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：不得检出/g、ml或10cm2 （各外用制剂均同）3）用于表皮或粘膜完整、含药材原粉的：细菌数：≤10 000 cfu /g或10cm2，≤100 cfu/ml霉菌和酵母菌数：≤100 cfu /g、ml或10cm2金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：不得检出/g、ml或10cm2 （各外用制剂均同）4）眼部给药制剂已全提升为无菌制剂原：细菌数：≤10 cfu /g或ml霉菌和酵母菌数：每1g或1ml不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌：每1g或1ml不得检出5）耳、鼻及呼吸道给药制剂细菌数：≤100 cfu /g、ml或10cm2霉菌和酵母菌数：≤10 cfu /g、ml或10cm2金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌:不得检出/g、ml或10cm2大肠埃希菌：鼻及呼吸道给药制剂, 不得检出/ g、ml或10cm26）阴道、尿道给药制剂细菌数：≤100 cfu /g或ml霉菌和酵母菌数：≤10 cfu /g或ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌：不得检出/g、ml或10cm27）直肠给药制剂细菌数：≤1000 cfu /g，≤100 cfu /ml霉菌和酵母菌数：≤100 cfu /g或ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：不得检出/g或ml8）其它局部给药制剂细菌数：≤100 cfu /g、ml或10 cm2霉菌和酵母菌数：≤100 cfu/g、ml或10cm2金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：不得检出/g、ml或10cm24、含动物组织及动物类原药材粉（蜂蜜、王浆、动物角、阿胶除外）的口服制剂：每10g或10ml还不得检出沙门氏菌5、有兼用途径制剂：应符合合途径的标准6、霉变、长螨者：以不合格论。
熊胆粉微生物限度检查方法学验证
熊胆粉微生物限度检查方法学验证目的建立熊胆粉微生物限度检查方法，并对方法进行验证。
方法采用《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法对熊胆粉进行微生物限度检查。
结果用pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备样品，可采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）进行细菌计数；采用培养基稀释法（400 mL 营养肉汤）进行沙门菌检查；采用1∶10供试液的常规法进行霉菌及酵母菌计数和控制菌检查。
结论该方法消除了样品的抑菌性，可用于该品种的微生物限度检查。
[Abstract] Objective To set up the microbial limit test ways for bear gall powder and verification of the method. Methods A microbial limits method of Chinese Pharmacopeia (2010 edition) part one appendix ⅩⅢC was used to detected the microbial limit test method of bear gall powder. Results Sodium chloride-peptone aseptic buffer solution (pH=7.0) was used to prepare the test sample. Culture media dilution (1∶20 sample solution, 0.1 mL/dish) was used to count the bear gall powder bacteria. Salmonella test method for culture media dilution method (400 mL NB) was used. 1∶10 selected liquid was adopted to do the mildew and yeast count and control bacteria inspection by the conventional method. Conclusion This method can eliminate the antimicrobial properties and it can be used for the microbial limit test for bear gall powder.[Key words] Bear gall powder; Microbial limit test; Validation熊胆粉为熊科动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，收载于国家药品标准《新药转正标准》第11册[1]，本品有一定的抑菌作用[2]，但其微生物限度檢查一直采用常规方法检验，根据《中国药典》2010年版的要求，对原用的常规方法进行验证[3]。
微生物限度检查法标准操作规程
微生物限度检查法标准操作规程一、目的：建立一个微生物限度检查标准操作规程，规范质检员的操作，保证实验的安全性、准确性。
二、范围：适用于微生物限度检查的产品。
三、责任：QC部质检员对本规程实施负责。
四、内容1.检验依据：《中国药典》2010年版二部。
2. 简述2.1.微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌数检查。
2.2.微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
2.3.供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
2.4.除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃2.5.检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
3.设备、仪器3.1.设备：3.1.1.洁净实验室：微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。
结构和要求：洁净室应采光良好，避免潮湿、远离厕所及污染区。
操作间与缓冲间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。
洁净实验室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙壁与地面、天花板连接处无缝隙，不留死角。
操作间不应安装下水道。
洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LX。
●温度、湿度：洁净实验室内温度应控制在18～26℃，相对湿度最好在40％～60％。
●操作间：操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
消毒剂验证文件全资料--依据2010版中国药典
验证文件一（FA）消毒剂消毒效果验证方案编号： YZ-FA014-05目录1、验证方案的起草、审核和批准2、验证小组人员及其职责3、消毒剂简介4、验证目的5、确定验证检测项目6、验证所需仪器设备7、验证方法7.1洁净区清洁消毒7.2洁净室采样7.3取样点分布7.4取样方法7.5计算公式7.6判定标准8、血液制剂车间消毒剂消毒效果验证结果统计表8.1 75%乙醇消毒效果验证结果8.2 0.1%新洁尔灭消毒效果验证结果9、相关文件10、验证结果评价1.验证方案的起草、审核和批准兹证明我已审核并批准洁净区洁净服清洗灭菌效果验证方案。
批准人：年月日2.验证小组人员及其职责3.消毒剂简介3.1常用消毒剂3.1.1 75%乙醇3.1.2 0.1%新洁尔灭3.2消毒剂的主要用途用于洁净室操作台、天顶、地面、门窗、地漏、设备表面、洁净室清洁用具及操作人员手部消毒等。
4.验证目的本验证的目的是通过实验以证明洁净室使用的主要消毒剂（75%乙醇、0.1%新洁尔灭）对环境、设备表面灭菌的可靠性和重现性，确认洁净室消毒剂（75%乙醇、0.1%新洁尔灭）在进行消毒时能对环境、设备表面的细菌进行有效的杀灭，以确保生产环境得以控制。
5.确定验证检测项目按规定消毒程序对生产环境进行消毒，按2010版《中国药典》微生物限度检查法检测微生物数及检测环境微生物数。
6. 验证所需仪器设备7. 验证方法7.1洁净室清洁消毒按照生产部《生产区清洁消毒标准操作规程》（SOP-WS012-05）分别清洁、消毒洁净工作区百级、万级、十万级操作间的工作台面、设备表面、地板、墙面和门窗等。
7.2 洁净室采样选取制品暴露时间最长、设备和操作人员最多，无菌要求最高的分装操作间作为验证测试重点。
7.3 取样点分布：测定沉降菌平皿平面分布图(见附图一)，棉签取样分布图（图二），或根据所需培养皿数决定培养皿在室的分布，力求平均分布。
附：图一 附： 图二7.4取样方法：在洁净室墙面、地面、门窗、设备等表面清洁消毒完成后，用经高压灭菌过的无菌棉签蘸取少量灭菌生理盐水（使其湿润），在上述取样点表面上擦拭，取样面积为每签每个点10cm2，完成后放入经灭菌处理的生理盐水，按微生物限度检查法进行细菌和霉菌的培养和检查。
《中国药典》2010年版一部收载微生物限度标准
《中国药典》2010年版一部收载微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的危害而制订的。
药品的生产、贮存、销售过程中的检验，中药提取物及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1. 制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。
2. 口服给药制剂2.1 不含药材原粉的制剂细菌数每1g不得过l000cfu。
每lml不得过100cfu。
霉菌和酵母菌数每lg或lml不得过100cfu。
大肠埃希菌每1g 或lml不得检出。
2.2 含药材原粉的制剂细菌数每1g不得过l0000cfu（丸剂每1g不得过30000cfu）。
每lml不得过500cfu。
霉菌和酵母菌数每lg或lml不得过100cfu。
大肠埃希菌每1g 或lml不得检出。
大肠菌群每1g应小于100个。
每1ml应小于10个。
2.3 含豆豉、神曲等发酵原粉的制剂细菌数每1g不得过l00000cfu。
每lml不得过1000cfu。
霉菌和酵母菌数每lg或lml不得过500cfu。
每lml不得过100cfu。
大肠埃希菌每1g 或lml不得检出。
大肠菌群每1g应小于100个。
每1ml应小于10个。
3. 局部给药制剂3.1 用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3.2 用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂细菌数每1g或l0cm2不得过1000cfu。
每lml不得过100cfu。
霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2不得过100cfu。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。
3.3 用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂细菌数每1g或l0cm2不得过10000cfu。
每lml不得过100cfu。
霉菌和酵母菌数每1g、lml 或l0cm2不得过100cfu。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml 或l0cm2不得检出。
2010版药典培养基适用性检查指南
培养基适用性检查▪计数实验的培养基适用性该部分内容均为新增规定了该内容的应用范围采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法标准菌种为：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限引入了对照培养基的概念判定的依据：回收率大于70％，且形态一致▪控制菌检查的培养基适用性该部分内容均为新增规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目采用标准菌种比较的判定方法根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检查方法在检查中引入了涂布接种的概念1.概述培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。
计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。
培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价拍段检验用培养基是否符合检验要求。
微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。
2010《版中国药典》微生物限度检查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。
2、培养基适用性检查实验的一般要求2.1培养基适用性检查适用范围2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
培养基使用性检查试验可用于确定实验室所用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。
即上述影响培养基质量的各关键控制点应通过培养基使用性检查试验确定，如果任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。
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乙型副伤寒沙门菌 金黄色葡萄球菌
沙门菌
胆盐硫乳琼脂培养基或沙 促生长能力+指示 门、志贺菌属琼脂培养基 能力
乙型副伤寒沙门菌
曙红亚甲蓝琼脂培养基或 促生长能力+指示 麦康凯琼脂培养基 三糖铁琼脂培养基 能力 指示能力
乙型副伤寒沙门菌
乙型副伤寒沙门菌
亚碲酸盐肉汤培养基
促生长能力 抑制能力
金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
菌数报告规则
• 细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300CFU • 霉菌宜选取平均菌落数小于100CFU 的稀释级，作 为菌数报告（取两位有效数字）的依据。
10 0 3000 3000 10 -1 310 320 10 -2 32 30
报告细菌数
• 以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、 lml 或10cm2供试品中所含的菌数。
• 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养 5 ～7 天，加人3 ～5ml 含0.05 % ( ml /ml ）聚山梨酯80 的0.9 ％ 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子 悬液至无菌试管内，用含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80 的0.9％ 无菌氯化钠溶液制成每lml 含孢子数50 ～ 100CFU 的孢子悬液。 • 菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8 ℃ ，可在24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2 ～8 ℃ ， 在验证过的贮存期内使用。
10 0 239 241 10 -1 133 151 10 -2 10 14
报告细菌数
• 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最 低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落 数小于1 时，以＜1 乘以最低稀释倍数的值 报告菌数
10-1 2 0 1 0 27 19 3 5 0 0
10-2 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0
大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌
枯草芽抱杆菌
30～35 ℃ 培养48 小时，计数 白色念珠菌 黑曲霉
23 ～28 ℃ 培养72 小时
白色念珠菌 23 ～28 ℃ 培养72 小时
结果判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对 照培养基上的菌落平均数的70 % ，且菌落 形态大小与对照培养基上的菌落一致，判 该培养基的适用性检查符合规定。
供试品检查
1:1 1:10 1:100 1:1000 1ml稀释液
PCA 细菌
玫瑰红钠 霉菌
YPD 酵母菌
培养和计数 • 除另有规定外，细菌培养3 天，霉菌、酵母 菌培养5 天，逐日观察菌落生长情况，点计 菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告。 • 一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰 红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数； 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母 菌计数。
供试液的制备
• 1.液体供试品 • 2.固体、半固体或黏稠性供试品 • 3.需用特殊方法制备供试液的供试品 （1）非水溶性供试品 （2）膜剂供试品 （3）肠溶及结肠溶制剂供试品 （4）气雾剂、喷雾剂供试品 （5）贴剂供试品 （6）具抑菌活性的供试品
1.液体供试品
取供试品10ml ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液至100ml ，混匀，作为l:10 的供试液。 油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品 分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品 原液作为供试液。
计数方法的验证
菌种及菌液制备 同计数培养鉴的适用性检查。
验证方法
• 验证试验至少应进行3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次 试验的回收率。 ( l )试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液lml 和50 ～ 100CFU 试验菌，分别注人平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平 行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试 验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加人 50～100CFU 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。 ( 2 )菌液组 测定所加的试验菌数。 ( 3 )供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 ( 4 )稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤 等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受 影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最 终菌浓度为每lml 供试液含50 ～100CFU ，按试验组的供试液制备方法和菌 落计数方法测定其菌数。
菌液制备
• 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至营 养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18 ～24 小时，用0 . 9 ％ 无菌氯化钠溶液制成每lml 含菌数为50～100CFU 的菌悬液。 • 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培 养基上，培养24～48 小时，用0 . 9 ％无菌氯化钠溶液制成每lml 含菌 数为50～100CFU 的菌悬液。
• • •
1ml供试液 50 ～100CFU 试验菌
1ml稀释液 取规定量供试液
试验组
菌液组
稀释剂对照组
供试品对照组
结果判断 在3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌 数回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组 的平均菌落数的百分率）应均不低于70 % 。若试 验组的菌数回收率（试验组的平均菌落数减去供 试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌 落数的百分率）均不低于70％，照该供试液制备 方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌 数；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70 % ，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过 滤法、中和法（常见干扰物的中和剂或灭活方法 见表1 ）等方法或联合使用这些方法消除供试品 的抑菌活性，并重新进行方法验证。
微生物限度
2010版药典
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制 剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方 法。 检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌 数及控制菌检查。
• 微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局 部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。 • 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂 或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。 • 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温 度为30～35 ℃ ；霉菌、酵母菌培养温度为23～28 ℃。 • 检验结果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2 为单位 报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
10 -2 1 2 10 -1 22 18 10 0 178 180
报告细菌数
10 -3 0 0
10 -2 4(1) 6(1)
10 -1 22 18
报告细菌数
1.若比值小于等于2时，按照上述第三条； 2.若比值大于2但不超过5，以低稀释级的平均菌 落数乘以稀释倍数的值报告菌数； 3.当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或 等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原 因再行检查检查
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌各 50～100CFU ，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂 培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置 30～35 ℃ 培养48 小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各 50～100CFU ，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠 琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，混匀，凝固， 置23 ～28 ℃ 培养72 小时，计数；取白色念珠菌50 ～ 100CFU ，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄 糖琼脂培养基．平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置23 ～ 28 ℃ 培养72 小时，计数。 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
2.固体、半固体或黏稠性供试品
取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液至100ml ，用匀浆仪或其他适宜的方法，混 匀，作为1:10 的供试液。必要时加适量的无菌聚 山梨酯80 ，并置水浴中适当加温使供试品分散均 匀。
具抑菌活性的供试品
• 当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除 供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。 • ① 培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基 中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。 • ② 离心沉淀法 取一定量的供试液，500 转／分钟离心3 分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。 • ③ 薄膜过滤法 • ④ 中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品， 可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭 活剂可加在所用的稀释液或培养基中。
适用性检查 控制菌检查用培养基的适用性检查项目 包括促生长能力、抑制能力及指示能力的 检查。
控制菌检查
培养基 胆盐乳糖培养基
特性 促生长能力 抑制能力
试验菌株 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
大肠埃希菌
4-甲基伞形酮葡糖苷酸 培养基 曙红亚甲蓝琼脂培养基 或麦康凯琼脂培养基 乳糖胆盐发酵培养基
10-3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
CFU/ml
控制菌检查
控制菌检查用培养基的适用性检查
菌种 对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC ( B ) 44l02] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ] 乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B ) [ CMCC ( B ) 50094 ] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ） [ CMCC ( B ) 10104 ] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes ) [ CMCC ( B ) 6494l] 白色念珠菌（Candida albicans ） [ CMCC ( F ) 98001 ]
促生长能力+指示能力
促生长能力+指示能力 促生长能力 抑制能力