精子获能处理

“试管动物”的基本程序
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（一）卵母细胞的采集 1、离体卵巢采卵：是从屠宰母畜的卵巢采集卵母细胞（主 要来源） （1）卵泡抽吸法 （2）卵巢解剖法 2、活体采卵：是从活母畜的卵巢采集卵母细胞（优良品种）
B超引导法：借助超声波(B超)探头和屏幕的引导，从活母 畜卵巢采集卵母细胞。操作员先将带有B超探头和采卵针的 采卵器通过阴道插入子宫，同时通过将卵巢贴在探头上。根 据B超屏幕所显示的卵泡位置，利用采卵针穿刺卵泡并同时 抽吸卵母细胞。其优点是可反复进行采卵而对母畜伤较少。 其缺点是技术难度较大，而且需要较昂贵的B超设备。
3、培养时间： 牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为 22～24h，而马为30～36h，猪为40～44h。
4、培养方法：卵母细胞体外成熟的培养方法一般采用微滴 法、封闭法和开放法三种。
（三）卵母细胞的体外受精（IVF）
1、精子的制备：悬浮法（swim up）；直接离心法；哌可 （Percoll）密度梯度离心法
2、精子获能处理：肝素处理法；钙离子载体法；高渗溶液 处理法
3、受精液：通常使用Tyrode’s改良液 4、受精方法：微滴法、四孔培养板法 5、精卵共培养的时间、温度和气相：受精后，卵母细胞应
立CO即2培放养入箱温中度培39养℃2，4～含454％h，CO其2的中空牛气22和～最24大h，相将对假湿定度的的受 精卵从受精液中取出，再在早期胚胎体外培养液中继续培 养18～33h。受精后40～44h检查受精卵的分裂率
胚胎移植
http://knol.google.com/k/shahar-...dt36v/13
“试管动物”研究存在的问题
多精受精 长期以来多精受精问题一直是体外受精的一个难点。 目前，判定卵母细胞成熟的标准是核成熟(MII) 但是，仅仅根据 核成熟来判定卵母细胞的成熟看来并不全面，卵母细胞成熟应包 括核成熟、细胞质成熟、透明带成熟等。这样卵细胞在受精过程 中才能发生协调完整的生理变化，保证多精阻拒，以及激发精子 在卵母细胞内继续发育的能力。
非手术法移植：（1）先将胚胎装入0.25ml的塑料细管内； （2）直肠检查黄体位置后，最好先作硬膜外腔麻醉，然 后似人工授精般将胚胎用移植管通过子宫颈放入到与黄体 同侧的子宫角的大弯或大弯深处内，或两侧子宫角各放一 枚胚胎。
一般来说，用非手术法移植不如手术成功率高，因为容易 损伤子宫角引起炎症，使胚胎不能顺利附植。非手术法成 功率为25％-45％，而手术法可达 60％-65％。
试管大白鼠和试管婴儿。 1982年，美国人Brackett等成功报道了世界首例体内成熟的卵
母细胞经体外受精后获得试管犊牛。 我国学者卢克焕在爱尔兰建立了一整套牛体外受精技术体系，
并利用该技术体系于1987年生产了世界上数量最多的试管牛群， 并于1988年初又研究成功了世界首例完全体外的试管双犊。 蒋和生等于1993年利用体外成熟的卵母细胞进行IVF，获得了 我国首例试管水牛。
（四）早期胚胎的体外培养（IVC）
1、培养液：基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生素、 碳水化合物和蛋白质等。
2、胚胎体外培养系统：常规培养系统、输卵管离体培养系 统、与体细胞共培养系统。
3．培养方法：卵子在受精24h后，转移到预先制备好的颗粒 单层中继续培养。一般使用微滴培养法。
4、培养的温度和气相环境：和卵母细胞成熟的条件一样。 5．胚胎的回收及其质量评定：以牛为例，整个体外受精程
序，从卵母细胞成熟培养开始，经过体外受精和体外培养 直至受精卵发育到囊胚阶段，一共经历8d的时间。如定受 精当天为0d，则受精后第5～6d即可回收桑椹胚，第7～ 8d回收囊胚。
http://zupei.xjtu.edu.cn/jxzl_img.asp?id=574
（五）胚胎的移植（ET）
手术法移植：在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢 并观察黄体发育情况，然后用注射器或移植管将含有胚胎 的培养液或冲冼液注入到子宫角内或输卵管内。
试管动物
Test-tube Animal
概述
“试管动物”的概念 “试管动物”的主要研究
内容 “试管动物”的发展历史 “试管动物”的基本程序 “试管动物”研究存在的
问题
“试管动物” 的概念
在自然条件下，哺乳动 物精子和卵子的受精过程是 在体内完成的。如将精子和 卵子分别从公、母畜体内取 出并经过一系列的处理，使 精卵在体外条件下结合的过 程，称为体外受精(in vitro fertilization，IVF)。 由于卵子和精子的受精过程 实 是验在室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为 “试管动物”，如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴 儿”等。
“试管动物”的主要研究内容
一、体外受精 卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM) 精子体外获能(capacitation) 卵子和精子的体外受精(in vitro fertilization, IVF) 受精卵的体外培养(in vitro culture, IVC) 二、胚胎移植(embryo transfer，ET)
“试管动物”的发展历史
1878年，澳大利亚科学家Schek就用兔进行过实验，此后 Onaoff、Pincus等科学家曾对家兔和小鼠进行过体外受精。
1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚Austin发现精子 capacitation现象以来，哺乳动物体外受精技术的已经走过了半 个世纪的历程。
1957年，张民觉和Austin在实验中发现了受精前的试管小兔。 于1970年、1974年和1978年分别产下了世界首例试管小白鼠、
卵母细胞的采集
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（二）卵母细胞的体外成熟（IVC）
1、培养液：用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液 是M199。培养时尚要加入一定的血清和激素。
2、温度和气相：牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞体外成 熟培养的温度一般为38～39℃。所有哺乳动物卵母细胞体 外的成环熟境培。养的气相一般要求在含5％C02的空气和最大湿度