临床免疫学和免疫检验第十一章 生物素-亲和素放大技术讲义

第十一章生物素-亲和素放大技术
生物素、亲和素是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。

生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。

第一节生物素的理化性质与标记
生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。

一、活化生物素
利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。

（一）标记蛋白质氨基的活化生物素
（二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。

（三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。

（四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。

1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。

2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。

用缺口移位法掺入到双链DNA中。

3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。

二、生物素标记蛋白质
（一）生物素化蛋白质衍生物的特性
生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。

（二）标记方法
1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。

通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。

2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。

（三）标记注意事项
1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。

2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。

3.为减少生物素标记蛋白质后，大分子物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。

4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。

第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记
亲和素和链霉亲和素是大分子蛋白，几乎可以和任何用于标记的物质结合。

一、亲和素及其活性
亲和素（AV）耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，尤其是与生物素结合后，稳定性更好。

每个亲和素
能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强。

二、链霉亲和素及其活性
链霉亲和素（SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。

链霉亲和素（SA）分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子。

三、亲和素（或链霉亲和素）的标记
用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有125I、胶体金、荧光素和化学发光物，大分子物质如酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素（FITC）和胶体金。

亲和素或链霉亲和素与酶的标记结合物的制备可用普通酶直接标记，还可以通过与生物素化酶复合物中的生物素结合，间接地与酶形成结合物。

几种制备亲和素（或链霉亲和素）与常用酶形成标记结合物的方法：
（一）亲和素的标记
1.HRP-亲和素结合物的制备
（1）改良过碘酸钠法
（2）戊二醛法
2.亲和素-生物素化HRP复合物的制备
3.亲和素-生物素化碱性磷酸酶（ABAP）复合物的制备
（二）链霉亲和素的标记链霉亲和素（SA）因表面所带正电荷少，且不含糖基，在实验中的非特异性结合远低于亲和素，因此目前以链霉亲和素标记的酶结合物更为常用。

1.HRP-SA结合物的制备采用过碘酸钠法直接标记。

2.SA-生物素化HRP复合物的制备。

3.AP-SA结合物的制备采用戊二醛二步法。

第三节生物素-亲和素系统的特点
生物素、亲和素结合的多级放大作用，以及BAS既可偶联生物大分子，又可连接标记材料的特性，使BAS不仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。

BAS的优越性：
一、灵敏度：每个亲和素分子有四个生物素结合部位，因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。

二、特异性：亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。

而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。

三、稳定性：亲和素与生物素间的亲和常数极高，结合形成的复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂等均不影响其结合。

四、适用性：生物素和亲和素可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素-受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系；而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。

五、其他：BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等），适用于不同的反应体系；而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用。

此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成。

第四节生物素-亲和素系统的应用
一、生物素-亲和素系统基本类型及原理
（一）以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB 法；后又发展了亲和素-生物素化酶复合物技术（ABC）。

（二）直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法，或称标记亲和素-生物素法（LAB）。

BAB法 BAB法也称为桥联亲和素-标记生物素法（BRAB），是以游离的亲和素（或链霉亲和素）作为桥联剂，利用亲和素的多价性，将检测反应体系中抗原-生物素化抗体复合物与标记生物素（如酶标生物素）连接起来，达到检测反应分子的目的。

ABC法 ABC法是在BAB法基础上的改良，其原理是预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。

当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC（或SABC）中未饱和的亲和素（或链霉亲和素）结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC（或SABC）标记体系连成一体进行检测。

BA法 BA（或LAB）法是以标记亲和素（或链霉亲和素）直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。

二、生物素-亲和素系统在酶免疫测定中的应用
（一）将BAS与ELISA偶联可提高ELISA的灵敏度：每个亲和素可结合4个生物素，可使反应明显放大；亲和素与生物素间极高的亲和力，使反应结合更牢固稳定，而且特异性高；用小分子生物素代替酶标记抗体，可减少反应中的空间位阻。

（二）生物素-亲和素系统可作为均相酶免疫测定中高效的酶活性调变系统。

三、生物素-亲和素系统在荧光免疫技术中的应用
通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲和素（或链霉亲和素）；也可采用游离亲和素（或链霉亲和素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲和素（或链霉亲和素）抗体的夹心法。

酶放大时间分辨荧光免疫分析（EATRFIA）则是在抗原与固相McAb和生物素化McAb反应形成夹心复合物后，加入碱性磷酸酶（ALP）标记的SA（ALP-SA）继续反应，经生物素和SA的高亲和力结合，形成复合物：固相McAb-Ag-（McAb-生物素化）-（SA-ALP）。

ALP再作用底物生成产物5-氟水杨酸，后者在碱性条件下，可与Tb3+-EDTA形成荧光寿命长且产额高的三元复合物用于检测。

四、生物素-亲和素系统在放射免疫测定中的应用
BAS主要与免疫放射分析（IRMA）检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）。

此外，BAS也可用于IRMA反应后B，F成分的分离。

该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心的麻烦，待测复合物与固相结合更牢固，操作更简便。

五、生物素-亲和素系统在分子生物学中的应用
BAS在分子生物学领域中的应用主要集中在：
1.以生物素标记核酸探针进行的定位检测
2.用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化
3.将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR用于抗原的检测【习题】
ABC法免疫组化检测技术中的桥是指
A.生物素
B.亲和素
C.生物素化的抗体
D.酶标生物素
E.第一抗体
『正确答案』B
『答案解析』ABC法免疫组化检测技术中的桥是指亲和素。