肝癌细胞培养(总结版)

BEL7402/hepG2/HCCLM等肝癌细胞培养过程

器材：

液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、离心机、

倒置显微镜、超净工作台、一次性吸管若干个、带塞培养瓶（不定个）、试管架、酒精灯、G6型号细菌过滤漏斗、无菌冻存管、液

氮瓶。

试剂：

RPMI l640培养液，胎牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，70%乙醇（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，胎牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。

器皿的消毒及准备：

清洗灭菌（浓硫酸、蒸馏水）：

（1）浸泡（酸浸）:新使用或重复使用的玻璃器皿须经浓硫酸

溶液浸泡过夜，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷

等物质，并消除其弱碱性。操作过程需戴防护用具。

（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后

经行烘干。

（3）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器

皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能

残留任何有害物质及化学药品等。

（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。

实验前准备工作:

操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消

毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线

照射60min可以消灭空气中大部分细菌。

细胞复苏：

冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须

快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应

马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然

后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解

冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培

养液。

实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就

位用酒精棉球擦拭实验台

（1）准备一消毒过的离心管（5ml即可）。

（2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入40℃水浴，不时摇动，使其急速融化，1-2min内完成。

（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上

的细胞都洗下来）。

（4）低速离心(1500r／min) 5min，去上清后加培养液（RPMI-1640），制成单个细胞悬液（可用滴管轻柔吹打）。

（6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中

培养。2-3天换一次培养基。

细胞传代：

当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存

空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶

内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代

细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。

（1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。

（2）向瓶内加入1ml胰酶，置于37℃培养箱内进行消化，1--

3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（直接加培养液）。

（3）将离心管放入离心管中，离心(1500r／min) 5min。

（4）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。

（5）取3个无菌培养瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精灯下过火消毒。

（6）将细胞悬液分装到培养瓶中，一传二或三。

（7）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。

细胞冻存：

细胞的冻存最常用的方法是液氮冷冻保存法，主要是加入适量

的保护剂缓慢的冷冻细胞。细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几

乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。

（1）选对数增生期细胞(细胞铺满度为90%左右时)，在冻存前

1d换液。

（2）按传代方法配制单个细胞悬液。

（3）再以1500r／min的速度离心5min，去掉上清液。再加配

制好的冻存培养液（培养液7ml，10%胎牛血清2ml，10%DMSO 1ml），用吸管轻轻吹打使细胞混合均匀。

（4）将细胞悬液分装入无菌冻存管中，每管1.5 ml（冻存液要先预冷到4℃）；在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

（5）冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温

度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后

放入液氮气中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（操作时应戴

防护眼镜和手套，以免液氮冻伤）。