透射电镜的样品制备技术ppt课件
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7
二.固定
• 目的
–尽可能保存组织和细胞在生活状态下的结构 –使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后
的冲洗和脱水等步骤中溶解和流失 –防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 –防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细
胞的超微结构遭受破坏
8
• 方法
–物理方法 •快速冷冻法 •干燥法
–化学方法 •浸泡固定法 •原位固定法 •灌流固定法
18
体外培养细胞的固定 • 单层细胞固定 • 悬浮细胞固定
加入融化的2%琼脂或BSA增加粘附性。 离心。
19
三.脱 水
• 目的
–将组织内部游离的水分脱净，有利于 浸透和包埋
• 常用脱水剂
–乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶
性差
–丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，
但易使组织变脆
20
脱水步骤
• 从低浓度至高浓度系列脱水
–50% 酒精 4℃ 10～15min –70% 酒精 4℃ 10～15min或过夜 –80% 酒精 室温 10～15min –90% 酒精 室温 10～15min –95% 酒精 室温 10～15min –95%酒精：95%丙酮（1：1）室温 10～15min –95%丙酮 室温 10～15min –无水丙酮 室温 40min 中间换一次
22
常用的包埋剂
具有低黏度、亲和性强和优良的切割性能， 切片透明度高，组织结构保存好，并能耐受 电子束的轰击及在低温下聚合的特点。
• 环氧树脂Epon812(进口) 渗入组织容易，对细胞结构保存好，较 常用。
• 丙烯酸酯（acrylic resin) 618(国产)
23
Lowcryl K4M：
为低温水溶性包埋剂，较常用。特点是低温下(-35 ℃) 可保持低黏度；在紫外光（波长360nm）下可聚合。聚合后 可在常温下切片；能较好地保持组织结构和抗原性及植物凝 血素结合部位，减少背景非特异性染色，故多用于免疫细胞 化学的包埋后染色。
4℃
10min
15
原位固定法
• 多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对 缺氧比较敏感的组织。以保证器官的血液 供给，避免缺血造成的组织损伤或自溶。
• 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下，
边解剖边在取材的部位局部滴加固定液， 直至组织达到适当的硬度为宜。
16
灌流固定法
• 指通过血液循环途径，将固定液灌 注到组织器官内，进行固定后再取材的 方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快 的组织器官，如中枢神经系统、心脏、 胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所 取组织的种类较多以及解剖关系比较复 杂、难以渗透的组织器官。
12
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
• 白色粉末，使用浓度为4％ • 优点
–对组织的浸透力强 –保存抗原性物质，多用于免疫电镜技
术中 • 缺点
–高浓度时可使组织结构流失，多不单 独使用
13
常用缓冲液
• 用于配制固定液和漂洗
0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细胞化学
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常用固定剂
• 戊二醛(Glutaraldehyde，GA)
–无色透明液体，pH=4，使用浓度为2.5～4％， 使用温度4℃。
– 优点
• 穿透能力强 • 能较好地保存蛋白质、碳水化合物的结构及酶的
活性 • 固定保存时间长(4℃可达数周至数月)
– 缺点
• 组织反差不好
• 对脂类无固定作用
• 固定后标本要充分冲洗
14
浸泡固定法
是将所取样品直接放入预冷固定液内固定 的方法，适用于大多数组织器官。最常用的 是戊二醛、锇酸双重固定。
操作步骤:
前固定： 2.5%-4%戊二醛 4℃ 1-2h或数月
漂洗：用配固定液的缓冲液 4℃ 2-4h 中间换3次
后固定：1%锇酸 4℃ 1.5-2h（培养细胞 30min）
漂洗： 蒸馏水
6
一.取材
• 从人体、动植物、细胞和微Leabharlann Baidu物的培养物中 选取电镜观察材料的过程。
• 在活体取材时要做到： •快─离体1～2min内放入固定液 •准─取材部位要准，有代表性 •小─1mm×1mm×1mm大小，太小时结构少， 太大时固定不充分结构保存不好 •轻─动作要轻，器械要锋利 •冷─0℃ ～ 4℃ ，器械、容器、固定液 均需预冷
• 包括全身灌流固定法（适用于小动 物）和器官灌流固定法（适用于大动 物）。
17
• 操作步骤（以全身灌流固定法为例） 麻醉要进行灌流的动物,将动
物固定于实验台上,打开胸腔暴露 心脏,将针头刺入左心室，剪开右 心耳以引出血液和灌流液。用注射 器或输液器缓慢注入37 ℃、 0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流 出液无血色为止,注入4 ℃固定液， 待组织变硬后取材。
10
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4) • 淡黄色块状结晶，使用浓度1～4％，
使用温度4℃。 • 优点
–对蛋白质和脂类有较好的固定作用 –可避免组织块收缩或膨胀 –可产生明显的反差
11
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4)
• 缺点 –分子量大，穿透能力差 –对碳水化合物和酶固定效果不好 –固定时间较长易引起组织变脆 –有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用 –光热作用时易发生变化
透射电镜的生物 样品制备技术
1
分为两类： • 透射电镜样品的基本制备技术
–超薄切片技术 –负染技术 • 生物样品特殊制样技术
2
超薄切片技术
3
• 概念:
指制备厚度低于100nm的切片技术。
• 特点：
• 是透射电镜生物样品制备技术中最 常见、最基本的技术；
• 是其他技术方法的基础； • 程序长、操作较复杂、精细。
21
四.浸透及包埋
• 浸透：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂
渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不 相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能 与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转 换剂为环氧丙烷。
• 包埋：目的是让包埋剂完全浸透到组织
细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性 和韧性，能够承受切片时的各种压力，以 便制备超薄切片.
4
生物医学样品的特点：
1、样品多样化，包括组织、细胞、微生物及生 物大分子。
2、含水量多、质地软、脱水时容易皱缩变形。 3、机械程度低，对电子束轰击的耐受力差。 4、多由低原子序数的元素组成，故导电性能差。 5、样品形态对试剂的PH值及温度较敏感
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主要步骤
• 取材 • 固定 • 脱水 • 浸透及包埋 • 切片 • 染色
二.固定
• 目的
–尽可能保存组织和细胞在生活状态下的结构 –使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后
的冲洗和脱水等步骤中溶解和流失 –防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 –防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细
胞的超微结构遭受破坏
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• 方法
–物理方法 •快速冷冻法 •干燥法
–化学方法 •浸泡固定法 •原位固定法 •灌流固定法
18
体外培养细胞的固定 • 单层细胞固定 • 悬浮细胞固定
加入融化的2%琼脂或BSA增加粘附性。 离心。
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三.脱 水
• 目的
–将组织内部游离的水分脱净，有利于 浸透和包埋
• 常用脱水剂
–乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶
性差
–丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，
但易使组织变脆
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脱水步骤
• 从低浓度至高浓度系列脱水
–50% 酒精 4℃ 10～15min –70% 酒精 4℃ 10～15min或过夜 –80% 酒精 室温 10～15min –90% 酒精 室温 10～15min –95% 酒精 室温 10～15min –95%酒精：95%丙酮（1：1）室温 10～15min –95%丙酮 室温 10～15min –无水丙酮 室温 40min 中间换一次
22
常用的包埋剂
具有低黏度、亲和性强和优良的切割性能， 切片透明度高，组织结构保存好，并能耐受 电子束的轰击及在低温下聚合的特点。
• 环氧树脂Epon812(进口) 渗入组织容易，对细胞结构保存好，较 常用。
• 丙烯酸酯（acrylic resin) 618(国产)
23
Lowcryl K4M：
为低温水溶性包埋剂，较常用。特点是低温下(-35 ℃) 可保持低黏度；在紫外光（波长360nm）下可聚合。聚合后 可在常温下切片；能较好地保持组织结构和抗原性及植物凝 血素结合部位，减少背景非特异性染色，故多用于免疫细胞 化学的包埋后染色。
4℃
10min
15
原位固定法
• 多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对 缺氧比较敏感的组织。以保证器官的血液 供给，避免缺血造成的组织损伤或自溶。
• 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下，
边解剖边在取材的部位局部滴加固定液， 直至组织达到适当的硬度为宜。
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灌流固定法
• 指通过血液循环途径，将固定液灌 注到组织器官内，进行固定后再取材的 方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快 的组织器官，如中枢神经系统、心脏、 胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所 取组织的种类较多以及解剖关系比较复 杂、难以渗透的组织器官。
12
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
• 白色粉末，使用浓度为4％ • 优点
–对组织的浸透力强 –保存抗原性物质，多用于免疫电镜技
术中 • 缺点
–高浓度时可使组织结构流失，多不单 独使用
13
常用缓冲液
• 用于配制固定液和漂洗
0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细胞化学
9
常用固定剂
• 戊二醛(Glutaraldehyde，GA)
–无色透明液体，pH=4，使用浓度为2.5～4％， 使用温度4℃。
– 优点
• 穿透能力强 • 能较好地保存蛋白质、碳水化合物的结构及酶的
活性 • 固定保存时间长(4℃可达数周至数月)
– 缺点
• 组织反差不好
• 对脂类无固定作用
• 固定后标本要充分冲洗
14
浸泡固定法
是将所取样品直接放入预冷固定液内固定 的方法，适用于大多数组织器官。最常用的 是戊二醛、锇酸双重固定。
操作步骤:
前固定： 2.5%-4%戊二醛 4℃ 1-2h或数月
漂洗：用配固定液的缓冲液 4℃ 2-4h 中间换3次
后固定：1%锇酸 4℃ 1.5-2h（培养细胞 30min）
漂洗： 蒸馏水
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一.取材
• 从人体、动植物、细胞和微Leabharlann Baidu物的培养物中 选取电镜观察材料的过程。
• 在活体取材时要做到： •快─离体1～2min内放入固定液 •准─取材部位要准，有代表性 •小─1mm×1mm×1mm大小，太小时结构少， 太大时固定不充分结构保存不好 •轻─动作要轻，器械要锋利 •冷─0℃ ～ 4℃ ，器械、容器、固定液 均需预冷
• 包括全身灌流固定法（适用于小动 物）和器官灌流固定法（适用于大动 物）。
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• 操作步骤（以全身灌流固定法为例） 麻醉要进行灌流的动物,将动
物固定于实验台上,打开胸腔暴露 心脏,将针头刺入左心室，剪开右 心耳以引出血液和灌流液。用注射 器或输液器缓慢注入37 ℃、 0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流 出液无血色为止,注入4 ℃固定液， 待组织变硬后取材。
10
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4) • 淡黄色块状结晶，使用浓度1～4％，
使用温度4℃。 • 优点
–对蛋白质和脂类有较好的固定作用 –可避免组织块收缩或膨胀 –可产生明显的反差
11
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4)
• 缺点 –分子量大，穿透能力差 –对碳水化合物和酶固定效果不好 –固定时间较长易引起组织变脆 –有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用 –光热作用时易发生变化
透射电镜的生物 样品制备技术
1
分为两类： • 透射电镜样品的基本制备技术
–超薄切片技术 –负染技术 • 生物样品特殊制样技术
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超薄切片技术
3
• 概念:
指制备厚度低于100nm的切片技术。
• 特点：
• 是透射电镜生物样品制备技术中最 常见、最基本的技术；
• 是其他技术方法的基础； • 程序长、操作较复杂、精细。
21
四.浸透及包埋
• 浸透：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂
渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不 相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能 与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转 换剂为环氧丙烷。
• 包埋：目的是让包埋剂完全浸透到组织
细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性 和韧性，能够承受切片时的各种压力，以 便制备超薄切片.
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生物医学样品的特点：
1、样品多样化，包括组织、细胞、微生物及生 物大分子。
2、含水量多、质地软、脱水时容易皱缩变形。 3、机械程度低，对电子束轰击的耐受力差。 4、多由低原子序数的元素组成，故导电性能差。 5、样品形态对试剂的PH值及温度较敏感
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主要步骤
• 取材 • 固定 • 脱水 • 浸透及包埋 • 切片 • 染色