第十四章基因工程和蛋白质工程简介
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级 结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结
构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周 密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。
• 研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞 因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及 抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。
第十四章基因工程和蛋 白质工程简介
PPT文档演模板
2020/11/28
第十四章基因工程和蛋白质工程简介
第十四章 基因工程和蛋白质工程简介
主要内容
•第一节 DNA重组与基因工程 •第二节 蛋白质工程简介 •第三节 核酸研究技术简介
第一节 DNA重组和基因工程
• 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体 DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外 源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克 隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有 的遗传性状。
•
N=ln(1-p)/ln(1-f)
• N 基因文库所包含克隆的数目；
• p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%
；
• f 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。
cDNA文库
•
真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外
显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使
•Recombinant DNA molecule
• Introduction into host cells by transformation of viral infection
• Host chromateme
•Cloning
•Slection for cells containing a recombinant DNA molecule
测序技术进展
同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳
•同位素标记 •平板电泳
•A•C•G •T
•单色荧光标记 •多色荧光标记 •平板电泳 •毛细管电泳
•A •C •G •T
•测序图谱
•T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T
引物标记法测序(Dye Primer)
•一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。
• 1/n 每一种低丰度的mRNA占总 mRNA的分数。
基因文库和cDNA文库的建立
•组
•载
织
体
•mRNA
•DNA
•cDNA
•甲基化，双 链接头DNA
•部分或完 全酶解DNA
•DNA长度分级
•可克隆之 DNA
•DNA与载体连接
•筛选出所 需要的克隆
•吸附有 DNA片段的
膜
•放射自显影
Southern和Western印迹法
•DNA frangment
•Electrophoresis
•Transfer of DNA by blotting
•32P-labled DNA probe
•Autoradiography
•Agarrose gel
•Nitrocellulose sheet
• 读出待
测序列
Βιβλιοθήκη Baidu
´ •C
T G A C T T C G A C A A
•5
•3´
´
DNA的测序仪示意图
•computer analysis
•样品槽
•成象透镜 •聚焦透镜
•高灵敏度相机 •旋光镜/棱镜组件
•凝胶中DNA移动方向
•输入光学系统 •激光器
DNA的化学测序示意图
• 反应试剂 •G反应：硫酸二甲酯 •G+A反应：甲酸 •T+C反应：肼 •C反应：NaCl+肼
•SDS-Polyacrylamide gel
•Polymer sheet
•Autoradiogram
DNA重组技术的应用
• (1) 开辟生物学研究的新纪元
• •反向生物学（invese biology）的诞 生 •（2）促进生物技术产业的兴起 • •基因药物 • •基因诊断和治疗 • •转基因动植物
•Ti辅助DNA
植
（给体质粒）
给体质粒
物
基
因
•III T-DNA的转移与整合
工
程
•Ti质粒转移并
•带有外源基
插入植物DNA
因的Ti质粒
•植物DNA
第二节 蛋白质工程简介
• 在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋
白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并 不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提出蛋 白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子 设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程 的重要组成部分。
•+ •AmpliTaq FS enzyme •dCTP, dATP, dGTP, dTTP •ddATP (terminator)
•+ •AmpliTaq FS enzyme •dCTP, dATP, dGTP, dTTP •ddCTP
•+ •AmpliTaq FS enzyme •dCTP, dATP, dGTP, dTTP •ddGTP
泳
•GGCCATCGTT
方
•GGCCATCGT
向
•GGCCATCG
•GGCCATC
•GGCCAT
•GGCCA •GGCC •GGC
•3´
•5´
•A
•T
G
C
T
A
T
A
•读出模 G •读出模 C
板互补序 列
C T A
板序列
G A T
C
G
C
G
•5´
•3´
• •5
´
•CTGACTTCGACAAAGAA •3 未知序列的单链DNA
•Autoradiogram
•Transfer protein
•Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody
•Autoradiography
•Protein band detected by specific antibody
•TGTT ´• 放射性标记的引物
DNA的 Sanger测
序法 (酶法)
•Klenow酶 •dNTP
•ddATP •ddCTP •ddTTP •ddGTP
• 反应混合物
•ddG •ddG •ddG •ddG
• 较大片段
• 凝胶电
泳
•A C T G
• 较小片段
• 读出模板
互补序列
•3´
•5
•G A C T G A A G C T G T T
噬菌体感染大肠杆菌的途径
DNA重组体的筛选
• • 载体特征的直接筛选
• • 菌落的原位杂交 • • 免疫学方法
• 如果外源DNA 插入，氨卞青霉素 抗性基因失活
• 如果外源DNA 插入，四环素抗性 基因失活
pBR322质粒结构
•复印至硝酸 纤维素膜上
•细菌菌落
•32P-cDNA
原位杂交法筛选 DNA重组体图解
基因文库
• 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的
分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基 因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需 要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为 genomic library。
• 基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因 以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：
•胰脏
胰岛素原的人工合成
•胰岛素原基因
•胰岛素原
•反转录酶
•与质 粒连接
•感染 E.coli
•(A)n •胰岛素原mRNA •cDNA
•重组质粒
•mRNA
•转化细菌
•I 二元载体系统
•外源基因
Ti
质
•Ti辅助质粒
•Ti辅助DNA 给体质粒
粒
为
载
•II 共整合载体
体
•宿主 特异性
•宿主 特异性
的
• pBR型质粒 •整合
•一、DNA重组的技术路线
•二、基因工程的应用与前景
•三、DNA体外重组常用的酶
DNA重组的 技术路线
•1、目的基因的制备 2、载体的构建 3、目的基因与载体 的重组 4、重组 体导入宿主 细胞进行扩增 5、克隆基因的鉴定
•Foreign DNA to be inserted
•+
•Joining
•Plansmid vector
•转化寄主细 胞
•蛋白质
•制备合成肽
•制备对所编码蛋白 专一的抗体
•测定出 AA顺序
•合成 cDNA探针
•用Southern印迹法 筛选DNA文库
•蛋白 质
•制备专一的抗体
•沉淀核糖体 分离mRNA
•基因或 cDNA
第三节 核酸研究技术简介
• 一、DNA序列测定 • 二、基因文库与cDNA文库 • 三 、 聚 合 酶 链 式 反 应 （ polymerase chain reaction,
编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加
工成熟的mRNA反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表
达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有
一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA
都通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA
并被克隆的总和称为cDNA文库。 RNA病毒的基因组是RNA，也必须将
RNA先转录成cDNA，再建立文库。
• 为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库 应含的克隆数的计算公式如下：
•
N=ln(1-p)/ln(1-1/n)
• N cDNA文库所包含克隆的数目；
• p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%；
•用NaOH菌体裂 解DNA变性
•单链DNA 结合到膜上
•杂交 •放射自显影
•与放射性cDNA杂 交的菌落的斑点
•限制性酶切割 •DNA分子
•限制片段 •琼脂糖电泳
Southern 印迹法
•带有DNA 片段的凝胶
•用缓冲 液转移
DNA
•转移至硝酸纤维素膜上
•凝胶 •滤膜
•与放射性标记 DNA探针杂交
•植物冠瘿瘤
pBR322质粒的结构
•Ti质粒结构
•太小不能被包装
•DNA
•用限制性内切酶 除去中间一段
•与外源DNA连接
•重组载体的体外包装
•头部前体
•多联体 •COS DNA •COS
•A蛋白 •COS
•带有外源DNA的 噬菌体
以噬菌体为载体进 行DNA克隆
•成熟的颗粒
•在宿主细胞内进行 DNA的装配过程
PCR）
DNA测序的基本战略
• 设法产生带标记的不同长度的成套DNA
片段，各带有标记的片段起点相同、终点不
同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处
都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相
差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影
后，根据长短排列，根据特定末端碱基的
DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。
• •酶法 •化学法
•测序技术进展
酶• 法 序 列 分 析 的 原 理
•模板 •3 •CCGGTAGCAACT •5
´
´
•引物 •5 •GG •3´
´
•dATP
•酶 反
ddCGTTPP•+ddATP
应 dTTP
•dATP
ddCGTTPP•+ddCTP
dTTP
•dATP
ddCGTTPP•+ddGTP
•AmpliTaq FS •dATP, dCTP, dGTP, dTTP
•ddCTP
•+
•ddATP
•ddGTP •ddTTP
• 测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进 行纯化，除去过量的ddNTP后上样。
三．基因文库与cDNA文库
•1．基因文库（genomic library） • cDNA文库（complemental DNA library ） •2 . 文库的构建
• •蛋白质技术和核酸技术的相互增强
生物酶工程示意图
•遗传设计
•酶的蛋白质结构功能 •新酶分子蓝图 •选择性修饰方案
•效用 •发 展
•产品
•新酶 •克隆酶
•DNA重组 技术
•突变酶
•遗传修饰
•DNA重组 技术
•酶基因
蛋白质技术和核酸技术的相互增强
•插入表达载 体
•基因或 cDNA
•推导出 AA顺序
• 反应结束后 ，将4管反应液 混合，经乙醇沉 淀后上样
•+ •AmpliTaq FS enzyme •dCTP, dATP, dGTP, dTTP •ddTTP
终止法测序(Dye Terminator)
•一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子)
•unlabeled primer •template DNA
dTTP
•dATP
ddCGTTPP•+ddTT
dTTP P
•GGCCA •GGCCATCGTTGA
•GGC
•GGCC •GGCCATC
•GGCCATCG •GGCCATCGTTG
•GGCCAT •GGCCATCGT •GGCCATCGTT
•A C G T
•GGCCATCGTTGA
•电 •GGCCATCGTTG
构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周 密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。
• 研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞 因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及 抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。
第十四章基因工程和蛋 白质工程简介
PPT文档演模板
2020/11/28
第十四章基因工程和蛋白质工程简介
第十四章 基因工程和蛋白质工程简介
主要内容
•第一节 DNA重组与基因工程 •第二节 蛋白质工程简介 •第三节 核酸研究技术简介
第一节 DNA重组和基因工程
• 基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体 DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外 源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克 隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有 的遗传性状。
•
N=ln(1-p)/ln(1-f)
• N 基因文库所包含克隆的数目；
• p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%
；
• f 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。
cDNA文库
•
真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外
显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使
•Recombinant DNA molecule
• Introduction into host cells by transformation of viral infection
• Host chromateme
•Cloning
•Slection for cells containing a recombinant DNA molecule
测序技术进展
同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳
•同位素标记 •平板电泳
•A•C•G •T
•单色荧光标记 •多色荧光标记 •平板电泳 •毛细管电泳
•A •C •G •T
•测序图谱
•T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T
引物标记法测序(Dye Primer)
•一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。
• 1/n 每一种低丰度的mRNA占总 mRNA的分数。
基因文库和cDNA文库的建立
•组
•载
织
体
•mRNA
•DNA
•cDNA
•甲基化，双 链接头DNA
•部分或完 全酶解DNA
•DNA长度分级
•可克隆之 DNA
•DNA与载体连接
•筛选出所 需要的克隆
•吸附有 DNA片段的
膜
•放射自显影
Southern和Western印迹法
•DNA frangment
•Electrophoresis
•Transfer of DNA by blotting
•32P-labled DNA probe
•Autoradiography
•Agarrose gel
•Nitrocellulose sheet
• 读出待
测序列
Βιβλιοθήκη Baidu
´ •C
T G A C T T C G A C A A
•5
•3´
´
DNA的测序仪示意图
•computer analysis
•样品槽
•成象透镜 •聚焦透镜
•高灵敏度相机 •旋光镜/棱镜组件
•凝胶中DNA移动方向
•输入光学系统 •激光器
DNA的化学测序示意图
• 反应试剂 •G反应：硫酸二甲酯 •G+A反应：甲酸 •T+C反应：肼 •C反应：NaCl+肼
•SDS-Polyacrylamide gel
•Polymer sheet
•Autoradiogram
DNA重组技术的应用
• (1) 开辟生物学研究的新纪元
• •反向生物学（invese biology）的诞 生 •（2）促进生物技术产业的兴起 • •基因药物 • •基因诊断和治疗 • •转基因动植物
•Ti辅助DNA
植
（给体质粒）
给体质粒
物
基
因
•III T-DNA的转移与整合
工
程
•Ti质粒转移并
•带有外源基
插入植物DNA
因的Ti质粒
•植物DNA
第二节 蛋白质工程简介
• 在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋
白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并 不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提出蛋 白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子 设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程 的重要组成部分。
•+ •AmpliTaq FS enzyme •dCTP, dATP, dGTP, dTTP •ddATP (terminator)
•+ •AmpliTaq FS enzyme •dCTP, dATP, dGTP, dTTP •ddCTP
•+ •AmpliTaq FS enzyme •dCTP, dATP, dGTP, dTTP •ddGTP
泳
•GGCCATCGTT
方
•GGCCATCGT
向
•GGCCATCG
•GGCCATC
•GGCCAT
•GGCCA •GGCC •GGC
•3´
•5´
•A
•T
G
C
T
A
T
A
•读出模 G •读出模 C
板互补序 列
C T A
板序列
G A T
C
G
C
G
•5´
•3´
• •5
´
•CTGACTTCGACAAAGAA •3 未知序列的单链DNA
•Autoradiogram
•Transfer protein
•Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody
•Autoradiography
•Protein band detected by specific antibody
•TGTT ´• 放射性标记的引物
DNA的 Sanger测
序法 (酶法)
•Klenow酶 •dNTP
•ddATP •ddCTP •ddTTP •ddGTP
• 反应混合物
•ddG •ddG •ddG •ddG
• 较大片段
• 凝胶电
泳
•A C T G
• 较小片段
• 读出模板
互补序列
•3´
•5
•G A C T G A A G C T G T T
噬菌体感染大肠杆菌的途径
DNA重组体的筛选
• • 载体特征的直接筛选
• • 菌落的原位杂交 • • 免疫学方法
• 如果外源DNA 插入，氨卞青霉素 抗性基因失活
• 如果外源DNA 插入，四环素抗性 基因失活
pBR322质粒结构
•复印至硝酸 纤维素膜上
•细菌菌落
•32P-cDNA
原位杂交法筛选 DNA重组体图解
基因文库
• 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的
分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基 因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需 要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为 genomic library。
• 基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因 以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：
•胰脏
胰岛素原的人工合成
•胰岛素原基因
•胰岛素原
•反转录酶
•与质 粒连接
•感染 E.coli
•(A)n •胰岛素原mRNA •cDNA
•重组质粒
•mRNA
•转化细菌
•I 二元载体系统
•外源基因
Ti
质
•Ti辅助质粒
•Ti辅助DNA 给体质粒
粒
为
载
•II 共整合载体
体
•宿主 特异性
•宿主 特异性
的
• pBR型质粒 •整合
•一、DNA重组的技术路线
•二、基因工程的应用与前景
•三、DNA体外重组常用的酶
DNA重组的 技术路线
•1、目的基因的制备 2、载体的构建 3、目的基因与载体 的重组 4、重组 体导入宿主 细胞进行扩增 5、克隆基因的鉴定
•Foreign DNA to be inserted
•+
•Joining
•Plansmid vector
•转化寄主细 胞
•蛋白质
•制备合成肽
•制备对所编码蛋白 专一的抗体
•测定出 AA顺序
•合成 cDNA探针
•用Southern印迹法 筛选DNA文库
•蛋白 质
•制备专一的抗体
•沉淀核糖体 分离mRNA
•基因或 cDNA
第三节 核酸研究技术简介
• 一、DNA序列测定 • 二、基因文库与cDNA文库 • 三 、 聚 合 酶 链 式 反 应 （ polymerase chain reaction,
编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加
工成熟的mRNA反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表
达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有
一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA
都通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA
并被克隆的总和称为cDNA文库。 RNA病毒的基因组是RNA，也必须将
RNA先转录成cDNA，再建立文库。
• 为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库 应含的克隆数的计算公式如下：
•
N=ln(1-p)/ln(1-1/n)
• N cDNA文库所包含克隆的数目；
• p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%；
•用NaOH菌体裂 解DNA变性
•单链DNA 结合到膜上
•杂交 •放射自显影
•与放射性cDNA杂 交的菌落的斑点
•限制性酶切割 •DNA分子
•限制片段 •琼脂糖电泳
Southern 印迹法
•带有DNA 片段的凝胶
•用缓冲 液转移
DNA
•转移至硝酸纤维素膜上
•凝胶 •滤膜
•与放射性标记 DNA探针杂交
•植物冠瘿瘤
pBR322质粒的结构
•Ti质粒结构
•太小不能被包装
•DNA
•用限制性内切酶 除去中间一段
•与外源DNA连接
•重组载体的体外包装
•头部前体
•多联体 •COS DNA •COS
•A蛋白 •COS
•带有外源DNA的 噬菌体
以噬菌体为载体进 行DNA克隆
•成熟的颗粒
•在宿主细胞内进行 DNA的装配过程
PCR）
DNA测序的基本战略
• 设法产生带标记的不同长度的成套DNA
片段，各带有标记的片段起点相同、终点不
同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处
都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相
差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影
后，根据长短排列，根据特定末端碱基的
DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。
• •酶法 •化学法
•测序技术进展
酶• 法 序 列 分 析 的 原 理
•模板 •3 •CCGGTAGCAACT •5
´
´
•引物 •5 •GG •3´
´
•dATP
•酶 反
ddCGTTPP•+ddATP
应 dTTP
•dATP
ddCGTTPP•+ddCTP
dTTP
•dATP
ddCGTTPP•+ddGTP
•AmpliTaq FS •dATP, dCTP, dGTP, dTTP
•ddCTP
•+
•ddATP
•ddGTP •ddTTP
• 测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进 行纯化，除去过量的ddNTP后上样。
三．基因文库与cDNA文库
•1．基因文库（genomic library） • cDNA文库（complemental DNA library ） •2 . 文库的构建
• •蛋白质技术和核酸技术的相互增强
生物酶工程示意图
•遗传设计
•酶的蛋白质结构功能 •新酶分子蓝图 •选择性修饰方案
•效用 •发 展
•产品
•新酶 •克隆酶
•DNA重组 技术
•突变酶
•遗传修饰
•DNA重组 技术
•酶基因
蛋白质技术和核酸技术的相互增强
•插入表达载 体
•基因或 cDNA
•推导出 AA顺序
• 反应结束后 ，将4管反应液 混合，经乙醇沉 淀后上样
•+ •AmpliTaq FS enzyme •dCTP, dATP, dGTP, dTTP •ddTTP
终止法测序(Dye Terminator)
•一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子)
•unlabeled primer •template DNA
dTTP
•dATP
ddCGTTPP•+ddTT
dTTP P
•GGCCA •GGCCATCGTTGA
•GGC
•GGCC •GGCCATC
•GGCCATCG •GGCCATCGTTG
•GGCCAT •GGCCATCGT •GGCCATCGTT
•A C G T
•GGCCATCGTTGA
•电 •GGCCATCGTTG