实验十一 从自然环境中分离纯化噬菌体
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体试验实验报告
噬菌体试验实验报告实验目的：本实验旨在通过噬菌体感染细菌的实验，了解噬菌体的生命周期、感染机制以及噬菌体与宿主细胞之间的相互作用。
同时，通过实验操作，加深对病毒学和微生物学基本概念的理解。
实验原理：噬菌体是一种寄生在细菌细胞内的病毒，它们通过吸附、注入、复制和释放四个阶段完成生命周期。
在实验中，我们利用特定的噬菌体和宿主细菌来模拟这一过程，并观察噬菌体对细菌的影响。
实验材料：1. 噬菌体悬液：含有特定噬菌体的溶液。
2. 宿主细菌培养液：含有适合噬菌体感染的细菌。
3. 琼脂平板：用于培养细菌和观察噬菌体感染效果。
4. 微量移液器和吸头：用于精确取样。
5. 无菌操作台：保证实验操作的无菌条件。
实验方法：1. 将宿主细菌培养液均匀涂布在琼脂平板上，待其凝固。
2. 使用微量移液器取适量的噬菌体悬液，滴加在涂布好的琼脂平板上。
3. 轻轻摇动平板，使噬菌体悬液均匀分布在平板上。
4. 将平板置于恒温培养箱中，培养一定时间，观察噬菌体感染宿主细菌后形成的噬菌斑。
5. 记录噬菌斑的数量和大小，分析噬菌体的感染效率。
实验结果：在培养一定时间后，观察到琼脂平板上出现了多个清晰的噬菌斑。
噬菌斑的数量和大小因噬菌体的浓度和宿主细菌的敏感性而有所不同。
通过计数噬菌斑的数量，可以估算噬菌体的感染效率。
实验讨论：噬菌体感染宿主细菌后，会迅速繁殖并导致宿主细胞破裂，释放出新的噬菌体颗粒。
噬菌斑的形成是由于噬菌体感染后，宿主细胞无法正常分裂，形成局部的透明区域。
噬菌斑的大小和数量可以反映噬菌体的感染力和宿主细胞的抵抗力。
实验结论：通过本次噬菌体试验，我们成功观察到了噬菌体的感染过程，并对其生命周期有了更深入的理解。
实验结果表明，噬菌体能够有效地感染宿主细菌，并在短时间内繁殖。
此外，噬菌体的感染效率和宿主细胞的敏感性密切相关，这为噬菌体在生物技术领域的应用提供了理论基础。
实验反思：在实验过程中，我们注意到了无菌操作的重要性，以及精确取样的必要性。
噬菌体分离纯化的原理和步骤
噬菌体分离纯化的原理和步骤1. 噬菌体简介好啦，大家，今天我们来聊聊一个有趣又神奇的东西，叫做噬菌体。
听起来像是外星人发明的玩意儿，其实它是一种专门攻击细菌的病毒，简直是细菌界的“灭霸”。
它们在微观世界中偷偷摸摸地工作，悄无声息地解决那些惹人烦的细菌问题。
咱们身边的细菌可不少，有的对我们有益，但有的却是个十足的“败类”。
这时候，噬菌体就像是细菌的天敌，真是太酷了！2. 分离纯化的意义2.1 为何要分离纯化噬菌体？那么，为什么我们要把噬菌体分离和纯化呢？首先，想象一下，如果你在一个大杂烩中找一颗珍珠，那可是相当困难的。
所以我们得把这些小家伙从杂乱的环境中“捞”出来，单独让它们站到聚光灯下。
这样一来，我们就可以更好地研究它们，了解它们是怎么攻击细菌的，有助于开发新的治疗手段，像是抗生素的替代品。
2.2 纯化的重要性再者，纯化的过程就像是给噬菌体洗澡，洗去那些多余的脏东西，只留下最纯粹的样子。
这样才能确保我们研究的数据准确，不然的话，可能会被一些“干扰分子”搞得一团糟。
想想，如果你的咖啡里多了一勺盐，那可就毁了整杯了，不是吗？3. 分离纯化的步骤3.1 收集样本接下来，我们来说说具体步骤。
第一步，得收集样本。
你可以从土壤、水源，甚至是一些腐烂的食物中找到细菌和噬菌体。
这可不是随便捞的，咱得选那些“鱼塘”丰富的地方。
想象一下，像在一片荒野中寻找“金矿”，可是比喻中的“金矿”得小心翼翼，别让细菌给我们添乱。
3.2 培养细菌收集好样本后，我们要把这些细菌培养起来。
通常用一些培养基，就像细菌的“自助餐”。
让它们在温暖的环境中肆意生长，像是细菌的“欢乐派对”。
可是咱可不能忘了，噬菌体也会趁机来“捣乱”，所以这时得时刻盯着它们的动态。
3.3 噬菌体分离一旦细菌培养得差不多了，就可以进行分离了。
这里可以用过滤的方法，把细菌和噬菌体分开。
想象一下，像是在过筛子，把沙子和金子分开，真是一场“筛沙子”的大比拼。
然后把留下来的液体提取出来，这里就大功告成了，噬菌体终于登场了。
噬菌体的分离与纯化
噬菌体的分离与纯化大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH 试纸，橡皮筋。
噬菌体的分离与纯化(整理优化版)
噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：，，琼0.7g离有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大培养（（～55℃（（直至骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止注意事项1.使用仪器要保证是灭菌的；2.注意琼脂的浓度；3.氯仿是易燃品，应远离火焰一、生物测定法1、双层琼脂平板法1）倒下层琼脂融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
2）倒上层琼脂融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入大肠杆菌菌液0.2mL，上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即34）2、45℃30℃1、11个底部注明噬菌体稀释度。
2、稀释噬菌体按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL 1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。
噬菌体与菌液混合将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。
分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
微生物的分离纯化综合实验
一、实验方案
1. 实验现象与结果
2. 本实验的关键环节及改进措施
⑴、接种环的灭菌操作要到位:接种环使用前, 直接在酒精灯上烧灼灭菌, 把环和金属丝烧红即可。
接种环使用后, 先在火焰周围把环上标本烤干, 再烧灼灭菌, 以免标本汽化, 爆烈四溅, 污染环境。
金属杆快速通过火焰2－3次, 杀灭表面微生物。
⑵、划线技术要很娴熟,具体要求参照上图。
⑶、整个过程要严格防止实验中被污染,每个阶梯稀释换新的移液管,要等平板冷却后再倒置。
思考题
1.食品中微生物为何繁殖迅速、种类繁多？
2.食品被微生物污染后有哪些危害？
3、检样稀释时, 每个稀释度都要更换刻度吸管, 为什么？
1.答:因为食品中含有大量的淀粉、蛋白质、糖类、脂肪等有机物, 且无机盐含量相对较低, 食品中含有一定的水分, 并且食品包装后容易使内部升温, 这些都是很适合微生物(细菌、原虫、病毒)生长繁殖的情况, 因此食品中的微生物能够繁殖迅速且种类繁多。
所以很多食物要严格灭菌或者添加防腐剂、干燥剂、脱氧剂等, 或者真空包装。
2.答:⑴、降低食品的营养；
⑵、引起食品腐败变质；
⑶、引起呕吐、中毒或者某些疾病(如痢疾、腹泻、呼吸道感染等)和潜在性的慢性危
害等。
3.答: 每个稀释度都要更换刻度吸管可以在一定程度上保证不会沾有上一个稀释度得溶液, 且减少污染, 使浓度稀释得更加准确, 增加实验结果的准确性。
指导教师评语及评分:
签名: 年月日。
细菌的噬菌体分型
细菌的噬菌体分型实验二细菌的噬菌体分型第一部分肠杆菌科噬菌体的分离、纯化与增殖噬菌体广泛存在于自然界。
凡是有细菌存在的地方，一般都能找到相应的噬菌体。
例如，土壤、肥料、腐烂有机物、粪便和阴沟污水等常是各种细菌的栖息地，从中能分离到相应的噬菌体。
从自然界分离某一噬菌体需要经过以下步骤:培养宿主菌(或叫做敏感菌);采集含噬菌体的样品;噬菌体富集培养;制备噬菌体裂解液;验证噬菌体的存在;噬菌体的纯化;噬菌体的增殖;噬菌体的效价测定和保存。
下面以大肠杆菌噬菌体为例详细介绍噬菌体的分离和纯化方法。
1( 噬菌体的分离(1)制备菌悬液:取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
(2)增殖培养:于10ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶(1支5ml吸管)中，加入污水样品20ml(1支5ml吸管)与大肠杆菌悬液0.2ml(1支1ml吸管)，37?培养12h,24h以增殖噬菌体。
(3)制备裂解液:将以上增殖的混合培养液2500r/min离心15 min(1支5ml吸管)。
将上清液倒入无菌平皿，针管抽取液体，在针栓式滤器上过滤除菌。
所得滤液倒入灭菌瓶内，取少量滤液作无菌试验，即将它接入牛肉膏蛋白胨培养液中(1支5ml吸管、1支1ml吸管、1支无菌带帽华氏管)，置于37?培养过夜，以作无菌检查。
(4)噬菌体确证试验:滤液经37?培养过夜，若无细菌生长则表明已经彻底除菌。
需进一步证明噬菌体的存在。
于已烘干的肉膏蛋白胨琼脂平板(平皿1个)表面加一滴大肠杆菌悬液(1支1ml吸管)，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。
放置数分钟，待琼脂表面干燥，在菌层的表面布点5个,7个，每点滴加上述滤液1小滴(1ml枪1把和枪头10个)，同时选择其中一点不加滤液只滴加一小滴生理盐水为对照，再放置数分钟，使液滴被琼脂吸干。
倒置平板，37?培养过夜。
次日观察结果，若平板上滴加滤液的部位出现噬菌斑，而在对照滴中处无噬菌斑，则表明该滤液中肯定含有大肠杆菌相应噬菌体。
环境中微生物的检测和分离纯化实验报告
环境中微生物的检测和分离纯化一．实验原理1.微生物的分离与纯化土壤中含有丰富的微生物，可以从中分离纯化得到很多有价值的菌株。
微生物常用的分离方法是平板分离法，根据某种微生物对生长条件的不同要求供给它适宜的培养环境，再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直到得到纯菌株。
2.平板菌落计数法将待测样品经适当稀释后，其中微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中含的菌落数。
二．实验材料与试剂1.土壤稀释溶液2.取液器（1000ml 1支），培养箱，培养皿（12个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000ml无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。
三．实验步骤（一）.无菌平板制备1.采用叠皿法把牛肉冻蛋白膏培养基倒入灭好菌的培养皿中，制作无菌平板（二）.周围环境中微生物的检测2.取一平板，分成6个区，做好标记。
同一个人同一根手指头按如下要求用力一致进行操作：分别用未洗过的手指头，自来水打湿的手指头，自来水认真洗过的手指头，洗手液洗过一遍的手指头，洗过两遍的，洗手液洗过又用酒精棉球消毒后的手指头在六个区上涂抹。
（平板1）3.取一平板，分区，分别用使用过的纸巾，硬币，旧纸币，餐卡在不同区拖动。
（平板2）4.在培养基上方抖动头发数次。
（平板3）5.取一平板，分区，用无菌接种环分别蘸一滴自来水，河水，豆浆在不同区划线。
（平板4）6.用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线。
（平板5）7.取两个平板，一个打开在实验台上放置30分钟，另一个在酒精灯火焰边打开皿盖1分钟。
（平板6）8.取一平板，打开盖，咳几下。
（平板7）（三）.从土壤中分离微生物1.采土样2.制备土壤稀溶液3.涂布吸取100ml稀释好的土壤稀溶液，较均匀地滴在平板上，再用无菌涂棒涂布均匀，涂1—2分钟4.培养将培养基平板倒置于37℃下培养24小时5.菌落计数四．实验结果1.平板1：从未洗到用酒精消毒总体趋势是菌落数越来越少，用自来水洗过和用洗手液洗过一遍的菌落数差不多；平板2：旧纸币和硬币的菌落数要多；平板3：抖头发的地方附近长出许多菌落；平板4：自来水菌落最多，其次是河水，河水的菌落分布成“牛”字形，和当时划线的形状一样，再其次是豆浆；平板5：划线的地方长出许多菌落；平板6：放在试验台上的平板长出各种形状的菌斑菌块，在酒精灯旁的基本没有菌落；平板7：咳几下的基本没有菌落。
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
1-3-3 实训 噬菌体的分离与纯化
（一）实训目的 • 学习分离纯化噬菌体的基本原理。 • 掌握纯化噬菌体的方法。 • 观察噬菌斑的形态和大小。
（二）实训原理 噬菌体广泛分布在自然环境中，在 其宿主存在的地方都可以找到噬菌体。 噬菌体对宿主有高度专一性，可利用 敏感菌株—宿主培养并发现它们；根 据噬菌体感染宿主并使之裂解，可在 敏感菌株(即宿主)的琼脂平板上出现 肉眼可见的噬菌斑，一个噬菌体可形 成一个噬菌斑，对此可进行计数。
④试验 上述滤液若无菌生长，可进行有、无噬菌体 存在的试验，其方法有试管法和琼脂平板法两种， 本实验用琼脂平板法。 • 步骤一：于肉汤琼脂平板上滴加大肠杆菌菌液一 滴，用无菌玻璃刮棒涂布成一薄层。 • 步骤二：待平板菌液干后，滴加上述滤液1小滴或 数小滴于平板上，再将此平板置于37℃培养过夜。 如滤液内有大肠杆菌噬菌体存在，即加滤液处便 无菌生长，而呈蚕食状的空斑。 • 步骤三：如已证明有噬菌体的存在，可再将滤液 接种于原已同时接种有大肠杆菌的肉汤内，如此 重复移种数次，即可使噬菌体增多。
（三）材料和用具 • 大肠杆菌斜面菌种(37℃，培养l8～24h)； • 上层肉汤蛋白胨琼脂培养基(含琼脂0.6%)， 底层肉汤蛋白胨琼脂培养基(含琼脂1.5%～ 2%)，三倍浓缩的肉汤蛋白胨培养基。 • 无菌吸管，无菌培养皿，无菌抽滤器，无菌 玻璃刮棒，三角瓶，恒温水浴箱，蔡氏细菌 滤器，真空泵，阴沟污水。
2.纯化 • ①滤液稀释 将含大肠杆菌噬菌体的滤液用 肉汤培养基按l0倍稀释法进行稀释，使成 5个稀释度。 • ②倒底层平板 用9cm直径的平皿5个，每 个平皿约倒l0mL底层琼脂培养基，依次标 明。 • ③倒上层平板 取5支各装有4mL上层琼脂 培养基的试管，依次标明。熔化后放于 50℃左右的水浴锅内保温，然后分别向每 支试管加0.1mL 大肠杆菌菌液和对号加入 0.1mL各稀释度的滤液，摇匀，然后对号倒 人底层琼脂平板上，摇匀铺平。
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
噬菌体的分离及其寄主细胞的鉴定
噬菌体的分离及其寄主细胞的鉴定噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，其存在的意义在于调节细菌数量，维持生态平衡。
与其他病毒不同的是，噬菌体的寄主是细菌，而细菌则作为噬菌体的繁殖基质。
因此，了解噬菌体的分离及其寄主细胞的鉴定对于维持微生物群落的稳定，维护人类健康具有重要意义。
一、噬菌体的分离方法噬菌体可以通过两种方法分离：（1）寄主膜破碎法；（2）巨细胞法。
寄主膜破碎法是最常用的噬菌体分离方法，其原理为化学溶解寄主菌的细胞壁和膜，使得噬菌体被释放。
该方法的具体步骤为：（1）将寄主菌接种到培养皿中；（2）加入一定浓度的化学物质，如Tween 80、SDS等，使得细胞壁和膜溶解；（3）离心沉淀，去除寄主菌留下噬菌体。
巨细胞法是一种体外培养细胞法，其原理为在营养缺乏的培养液中，将噬菌体感染到寄主细胞并使其增殖，形成巨细胞，最终分离出噬菌体。
该方法的具体步骤为：（1）通过定量PCR或滴定法测定噬菌体的初始含量；（2）将噬菌体感染到与其适宜的寄主细胞上，培养到合适的时间，直至形成巨细胞；（3）收集巨细胞，离心沉淀，分离出噬菌体。
二、寄主细胞的鉴定方法寄主细胞的鉴定是噬菌体研究中非常关键的一步。
它不仅可以确定噬菌体的寄主范围，还可以研究噬菌体与细菌之间的相互作用和生态响应。
常用的寄主细胞鉴定方法有三种：（1）凝胶探针法；（2）PCR法；（3）无基因片段标记法。
凝胶探针法是一种经典的寄主细胞鉴定方法，其原理为将寄主菌接种到寒暖交替的凝胶中，凝胶中形成的细胞克隆呈现不同的形态，通过寻找与噬菌体作用的细胞克隆，识别寄主细胞。
该方法虽然准确性较高，但需要大量耗时和耗材，难以大量应用。
PCR法是一种简便快速的寄主细胞鉴定方法，其原理为针对细胞壁或内质网上的基因间隔区，设计特异的引物，进行PCR扩增，通过扩增产物的测序或分子量鉴别寻找寄主细胞。
该方法的优势在于对样品的要求低，检测速度快，能够大量应用。
无基因片段标记法是一种新型的寄主细胞鉴定方法，其原理为将受噬菌体感染的细胞进行荧光标记或电化学标记，利用仪器检测关键生化分子的变化，直接寻找寄主细胞。
大肠杆菌噬菌体的分离纯化和最佳保存方法探索
大肠杆菌噬菌体的分离纯化和最佳保存方法探索
林阳君;庄梅琳;吴宝温
【期刊名称】《继续医学教育》
【年(卷),期】2018(032)008
【摘要】从自然水体中筛选分离筛选大肠杆菌噬菌体,探索其最佳保存方法,为今后进一步测定其生物学特征,评价其应用价值奠定研究基础.以大肠杆菌为宿主菌,用双层平板法从泉州市洛阳江河水中,经过筛选分离获得一株大肠杆菌噬菌体S2E-5,在温度4℃、-20℃、-80℃下,采用不同方法对其进行保存试验,并通过计算比较在不同保存方法前后噬菌体损失的滴度.结果表明对大肠杆菌噬菌体S2E-5,短期内可以将噬菌体原液直接保存在4℃,中期保存,需要加入10％甘油后置于4℃中保存,均是方便可靠的保存方法.而长期保存,则需要对噬菌体原液的进行真空冷冻干燥处理后置于4℃保存.
【总页数】3页(P126-128)
【作者】林阳君;庄梅琳;吴宝温
【作者单位】泉州医学高等专科学校药学院,福建泉州 362100;泉州医学高等专科学校药学院,福建泉州 362100;泉州医学高等专科学校药学院,福建泉州 362100【正文语种】中文
【中图分类】Q93
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微生物学实验大纲
生长谱法测定微生物生长的碳素营养。
实验十五 大分子物质的水解试验
一、实验目的
1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。
二、实验内容
1.淀粉水解试验。
2.油脂水解试验。
微生物学实验大纲
实验一 油镜的使用及细菌形态的观察
一、实验目的
1.复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
2.掌握细菌形态观察的基本方法，了解细菌的基本形态。
二、实验内容
1.学习油浸系物镜的使用方法。
2.观察细菌的基本形态。
实验二 细菌的单染色法及革兰氏染色法
1.用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。
2.用平板划线方法分离微生物。
3.实际计数微生物
实验十 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌菌落形态观察与识别
一、实验目的
1.了解不同的微生物在钭面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征。
2.识别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌四大类微生物的菌落特征。
3.进一步熟练和掌握微生物无菌操作。
二、实验内容
1.学习钭面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
2.观察已知菌的菌落的特征
3.根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。
实验十一 细菌鉴定中常用的生理生化反应实验
一、实验目的
1.了解细菌鉴定中常用的生理生化反应及原理。
2.掌握生化反应鉴定不同微生物的方法。
二、实验内容
1.利用德氏小管进行糖发酵试验。
一、实验目的
噬菌体分离实验报告
1. 学习噬菌体的分离方法。
2. 掌握噬菌体纯化技术。
3. 了解噬菌体形态和生物特性的观察。
二、实验原理噬菌体是一种感染细菌的病毒，具有高度的特异性。
噬菌体分离实验是通过在含有细菌的培养基上加入噬菌体，观察噬菌体对细菌的裂解作用，从而分离出纯化的噬菌体。
三、实验材料1. 实验组：大肠杆菌（Escherichia coli）菌种、噬菌体培养液、琼脂平板、无菌镊子、无菌滴管等。
2. 对照组：大肠杆菌菌种、无菌水、琼脂平板、无菌镊子、无菌滴管等。
四、实验步骤1. 制备培养基：将大肠杆菌菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养18小时。
2. 分离噬菌体：取一定量的噬菌体培养液，加入适量的无菌水进行稀释，取一定量的稀释液加入琼脂平板中，轻轻摇匀。
3. 制备平板：将制备好的培养基倒入平板中，待凝固后，用无菌镊子取适量的大肠杆菌菌液均匀涂布在平板表面。
4. 孵育平板：将平板倒置，37℃恒温培养24小时。
5. 观察结果：观察平板上的菌落，找出裂解斑，即噬菌体感染后的菌落。
6. 纯化噬菌体：用无菌镊子夹取裂解斑边缘的菌落，接种于新的琼脂平板中，37℃恒温培养24小时。
7. 观察纯化结果：观察平板上的菌落，若出现单菌落，则表明噬菌体已纯化。
8. 观察噬菌体形态和生物特性：将纯化的噬菌体培养液置于透射电镜下观察，观察噬菌体的形态。
同时，进行噬菌体的吸附实验、裂解实验等，了解噬菌体的生物特性。
1. 分离噬菌体：平板上出现裂解斑，表明噬菌体已成功分离。
2. 纯化噬菌体：平板上出现单菌落，表明噬菌体已纯化。
3. 噬菌体形态：透射电镜下观察到噬菌体呈长圆柱形，具有尾丝。
4. 噬菌体生物特性：吸附实验和裂解实验均表明噬菌体具有感染大肠杆菌的能力。
六、实验讨论1. 实验过程中，要注意无菌操作，避免污染。
2. 噬菌体分离实验的关键是裂解斑的观察，裂解斑的出现表明噬菌体已成功分离。
3. 噬菌体纯化过程中，要注意纯化程度的判断，避免杂菌污染。
除噬菌体的挑战实验
除噬菌体的挑战实验实验目的1、利用噬菌体的一些生物特性,从自然环境中分离、纯化大肠杆菌噬菌体,掌握噬菌体分离纯化的基本原理和方法。
在实验过程观察噬菌斑的形态,和细菌菌落进行对照加深印象。
实验原理噬菌体是专性寄生物,所以自然界凡是有细菌分布的地方,都可发现其特异的噬菌体存在。
如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，固也能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体。
噬菌体颗粒可以独立存活（当然不能生长）。
噬菌体存在的特征是使含有特定宿主的菌悬液由浑浊变清亮或者在有宿主细胞生长的琼脂平板上形成透明的或浑浊的空斑,称噬菌斑。
实验器材仪器设备:500ml三角瓶、中试管、培养皿、无菌不锈钢涂布器、无菌吸管、无菌滤器（孔径0.22um)、恒温水浴锅、真空泵、恒温培养箱、灭菌锅、抽滤瓶等试剂:大肠杆菌、三倍浓缩的牛肉膏蛋白陈液体培养基、含琼脂0.7%、2%的半固体、固体培养基、阴沟污水、无菌水等1.（第一天，实验员准备）制备大肠杆菌菌悬液:37℃培养18小时的大肠杆菌斜面一只,加无菌水5ml洗下菌苔，制成菌悬液。
2.(第二天）增殖培养:把40ml污水加到有20ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白陈培养液的三角瓶中,再加入0.6 ml大肠杆菌菌悬液，37℃振荡培养24～48小时。
3.(第三天）制备裂解液:制备裂解液将以上混合培养液加入1.5ml离心管（每人两管就够了)4000r/min离心15分钟,将上清转移到无菌离心管中(每次使用要无菌操作,用完后保存起来,以备下次使用）。
4.(第四天）确证实验于肉膏蛋白陈琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液(约0.1ml），再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。
(b)待平板菌液干后,分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面,里37℃培养过夜。
如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑,便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。
实验结果绘出平板中噬菌斑的形态特征。
噬菌体的分离与纯化
噬菌体的分离纯化及一步生长曲线的绘制前言噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。
目前对于噬菌体的研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面，在环境的治理方面的研究报道较少，因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体，掌握其生物学性质，应用所得噬菌体处理、净化生活污水，减少生活污水中病原性细菌的危害。
本研究以从小鹅中提取的大肠杆菌为宿主菌，从污水中分离噬菌体并进行纯化，最后绘制一步生长曲线。
1材料与方法1.1材料1.1.1菌种及样品菌种：从小鹅中提取的大肠杆菌，由老师提供。
污水来源：主要来自于农大出水口。
1.1.2试剂1mmol/L CaCl2溶液1.1.3试剂的配制(1) 液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5 g，NaCl 2.5g，加H2O至500mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(2) 3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl 1.5g，加H2O 至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(3) 固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌。
(4) 半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。
1.1.4主要仪器电热恒温培养箱（SHEL·LAB）、电热恒温水温箱（HHW21·Cu600，XMTD）、恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）、通风柜（M·TFG-A）、医用净化工作台（苏净集团安泰公司）、台式离心机（eppendorf）、台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、超低温冰箱（Forma Scientific）、YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、针头式细菌过滤器、0.22μm微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）、微量移液器（GILSON）、UVette(Eppendorf)。
1.2方法1.2.1噬菌体的分离1.2.1.1摇菌老师提供的大肠杆菌液加入5mL1×牛肉膏液体培养基，混合后，37℃振荡（120rpm）14h，此时大肠杆菌达到了对数生长期，取出4℃保存。
实验十一 从自然环境中分离纯化噬菌体
噬菌体分离和纯化的流程图
取20ml 水样 37℃ 振 荡培养 12-24h 离心收集 2500r/min 15min 上清 过滤
看板
分散滴 37℃ 过夜
加数滴
取 一 环
待 干 37℃过夜 培养 加0.1－0.2ml
EP管中加 0.9ml水
混匀 后取 0.2ml 加0.1ml 加0.1ml
立即倒 平板
③ 制备裂解液：将过夜培养物2500r/min离心15min，上清液用 无菌滤头过滤； ④ 确证实验：确证滤液中含有噬菌体的存在 在含有培养基的平板上加一滴大肠杆菌悬液，用灭菌涂布 器涂布均匀； 待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面， 置于37 ℃培养过夜；如果在滴加处形成无菌生长的透明 的噬菌斑，证明滤液中含有大肠杆菌的噬菌体。
蛋白胨 10g/L
酵母粉 5g/L NaCl 10g/L
琼脂 0.7%
琼脂 2%
四、实验操作步骤
（一）噬菌体的分离
① 制备菌悬液：平板上挑取适量E. coli接入LB摇瓶中，过夜培 养制成菌悬液；
② 增殖培养：于10ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 加入20ml污水样品和1ml大肠杆菌菌液，37℃震荡培养 12~24h；
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体(10-2的稀释液)。 2、培养基： LB琼脂平板(20ml培养基，2%琼脂，作底层培养基用)5个; 含琼脂培养基的试管(5ml，0.7%琼脂，作上层培养基用)5支。 3、仪器与其他用具： 含4.5ml无菌水小试管4支; 灭菌1.5ml Ep管 5个;
3、混合液加入到上层培养基中 (1) 将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5, 10-6,10-7和对照。 放置于48℃的水浴锅内。 (2) 分别将4管混合液和对照管加入对应的上层培养基试管中， 每加入一管就要立即摇匀。 4、上层培养基倒入底层平板上 (1)将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上，放在台面 上摇匀，使上层培养基布满平板。 (2)凝固后，置37℃培养过夜。
致仔猪痢疾沙门氏菌特异性噬菌体的分离与纯化
致仔猪痢疾沙门氏菌特异性噬菌体的分离与纯化席利萌;李陇平;徐坤;张智英【摘要】【Objective】 The study was to screen bacteriophage against Salmonella isolated in domestic sewage,and to provide certain reference for the development of diarrhea and disease prevention in piglets dysentery.【Method】 Salmonella was isolated and identified as host bacteria from the sicken piglet＇s feces,the specific bacteriophage screened from sewage through it;After mixing the isolated phage with Staphylococcus aureus（Sau） and Escherichia coli（Eco）,the specificity of the phage was validated.【Result】 The Salmonella were identified,and the specific phage isolated and purified can not kill Sau and Eco.【Conclusion】 We got the specific bacteriophage which can only kill the Salmonella,and the bacteriophage is specific.%【目的】筛选仔猪痢疾病原菌沙门氏菌特异性噬菌体,为噬菌体制剂的研制和仔猪痢疾的生物防治提供参考。
【方法】从患痢疾仔猪粪便中分离致病菌沙门氏菌,鉴定后以其为宿主菌,从生活污水中筛选、纯化出特异性噬菌体,并以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为对照,检测该噬菌体的特异性。
噬菌体富集筛选流程
噬菌体富集筛选流程Task Title: Bacteriophage Enrichment and Selection ProcessTask Title: 噬菌体富集筛选流程The bacteriophage enrichment and selection process is a crucial step in studying and utilizing these viruses that specifically infect and kill bacteria.It involves several key steps to isolate and purify the bacteriophages from environmental samples or produced in a laboratory setting.噬菌体富集筛选流程是研究并利用这些能特异性感染并杀死细菌的病毒的关键步骤。
该流程包括几个关键步骤，旨在从环境样本或实验室条件下生产中分离并纯化噬菌体。
Firstly, a suitable broth medium is prepared, which should promote the growth of both the target bacteria and the bacteriophages.This medium may contain nutrients such as peptones, yeast extract, and agar for solidification if needed.首先，准备一种合适的液体培养基，这种培养基应促进目标细菌和噬菌体的生长。
这种培养基可能包含肽类、酵母提取物以及如果需要的话，还有琼脂等营养成分。
样本或培养物与该培养基混合后, 将其放入培养箱中, 在适宜的温度下培养一段时间。
This allows the target bacteria to multiply and also provides an opportunity for the bacteriophages to lyse, or burst open, the bacteria,releasing progeny, or offspring, into the medium.将样本或培养物与该培养基混合后，放入培养箱中，在适宜的温度下培养一段时间。
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这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，可以使噬菌
体增殖、释放，从而可以分离得到特异的噬菌体。
在有宿主细胞生长的固体琼脂平板上噬菌体可以裂解细菌或限制感染
细菌的生长从而形成透明的空斑，这就是噬菌斑；一个噬菌体产生一个噬
菌斑，利用该现象可以将分离到的噬菌体进行纯化。
3、仪器与设备：
灭菌玻璃涂棒，灭菌Tip头，过滤器（0.22µm），注射器，恒温水浴箱 。
三倍浓缩牛肉膏 液体培养基 蛋白胨
上层培养基 底层培养基
牛肉膏 9g/L 蛋白胨 10g/L 蛋白胨 10g/L 蛋白胨 10g/L
蛋白胨 30g/L 酵母粉 5g/L
酵母粉 5g/L 酵母粉 5g/L
NaCl 15g/L
实验十一 噬菌体效价的测定源自一、目的要求学习噬菌体的效价的测定。
二、基本原理
噬菌体效价：是指1ml液体中所含的活噬菌体的数量。
效价测定的方法：一般是应用双层琼脂平板法。由于含 有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑， 因此能够进行噬菌体的记数。
因为噬菌体斑记数方法其实际效率难以接近100%（一般 偏低，因为少数活噬菌体可能未引起感染），所以为了准确的 表达病毒悬液的浓度（效价或滴度），一般不用病毒粒子的绝 对数量而是用噬菌体形成单位（plague-forming units，简写成 pfu）表示。
微生物学实验—2011级
实验十 从自然环境中分离纯化噬菌体
一、目的要求
学习从自然环境中分离、纯化噬菌体的基本原理。
二、基本原理
噬菌体是专性寄生物，自然界中凡是有细菌分布的地方均可以发 现特异的噬菌体的存在。
噬菌体DNA（或RNA）侵入细菌细胞后进行复制、转录和一系列基因
的表达并装配成噬菌体颗粒后，通过裂解宿主细胞而释放出来，可以使
四、实验操作步骤
1、稀释噬菌体 将4管含4.5ml水的试管分别标上10-3,10-4,10-5和10-6，用
1ml 无菌吸管吸0.5ml 10-2的大肠杆菌噬菌体，加入到10-3的 试管中，摇匀。依次类推，稀释至10-6管。
2、噬菌体与菌液混合 （1）将5支灭菌的空试管分别标上10-4,10-5,10-6,10-7和对照。 （2）用吸管从10-3噬菌体稀释管中吸0.1ml加入10-4空管中，再
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌（E. coli ET12567）
2、培养基：
摇瓶装三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基10ml（1瓶/组）； 试管液体培养基(5ml) （10支/组）; 上层培养基(含琼脂0.7%，试管分装，每管5ml) （10管/组）； 底层琼脂平板(含培养基20ml，琼脂2%) （10个/组）； 含4.5ml无菌水小试管（10支/组）
离心收集
2500r/min 15min
上清 过滤
看板
分散滴 37℃ 过夜 加数滴
取 一 环
EP管中加 0.9ml水
37℃过夜 培养
待 干
加0.1－0.2ml
混匀 后取 0.2ml
加0.1ml
加0.1ml
澄清
纯
立即倒
37℃
37℃
试管
噬
平板
培养24h
刺一下 培养24h 过滤
菌 体
微生物学实验—2011级
0.5ml
0.5ml
10-3
10-4
10-5
10-6
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
10-4
10-5
10-6
10-7
对照
10-4
10-5
10-6
10-7
用另外一支灭菌试管从10-4的噬菌体稀释管中吸0.1ml加入105的空试管中，依次类推，直至10-7的试管。 （3）将大肠杆菌摇匀,用吸管取菌液0.9ml分别加入上面的104,10-5,10-6,10-7和对照试管中。分别将上面的试管摇匀。
3、混合液加入到上层培养基中 (1) 将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5, 10-6,10-7和对照。
③ 制备裂解液：将过夜培养物2500r/min离心15min，上清液用 无菌滤头过滤；
④ 确证实验：确证滤液中含有噬菌体的存在
在含有培养基的平板上加一滴大肠杆菌悬液，用灭菌涂布 器涂布均匀；
待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面， 置于37 ℃培养过夜；如果在滴加处形成无菌生长的透明 的噬菌斑，证明滤液中含有大肠杆菌的噬菌体。
放置于48℃的水浴锅内。 (2) 分别将4管混合液和对照管加入对应的上层培养基试管中，
每加入一管就要立即摇匀。
4、上层培养基倒入底层平板上 (1)将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上，放在台面
上摇匀，使上层培养基布满平板。 (2)凝固后，置37℃培养过夜。
10-2
10-1
噬菌体原液
0.5ml
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体(10-2的稀释液)。 2、培养基： LB琼脂平板(20ml培养基，2%琼脂，作底层培养基用)5个; 含琼脂培养基的试管(5ml，0.7%琼脂，作上层培养基用)5支。 3、仪器与其他用具： 含4.5ml无菌水小试管4支; 灭菌1.5ml Ep管 5个; 灭菌Tip头; 48℃水浴箱
(二) 噬菌体的纯化
① 用接种环取一环滤液接种于0.9ml无菌水中，再加入0.1ml大 肠杆菌。
② 取上层琼脂培养基，溶化并放置于48 ℃水浴锅中，加入以 上的混合液0.2ml，立即混匀（也可先放置于水浴锅中融化， 然后拿出来放置，感觉不太烫手时加混合液）。
③ 并立即倒入底层琼脂上，铺匀，置37℃培养24h。
④ 此法分离的单个噬菌体，其形态大小常不一致，需进一步纯 化。噬菌体的纯化通常采用接种环在单个噬菌斑中刺一下， 接入含有大肠杆菌的液体培养基中，37 ℃培养。
⑤ 待管内的菌液完全裂解，变得澄清后，过滤菌液，就可得到 纯化的噬菌体。
噬菌体分离和纯化的流程图
取20ml 水样
37℃ 振 荡培养
12-24h
NaCl 10g/L
NaCl 10g/L NaCl 10g/L
琼脂 0.7%
琼脂 2%
四、实验操作步骤
（一）噬菌体的分离
① 制备菌悬液：平板上挑取适量E. coli接入LB摇瓶中，过夜培 养制成菌悬液；
② 增殖培养：于10ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 加入20ml污水样品和1ml大肠杆菌菌液，37℃震荡培养 12~24h；