血虚证实验动物造模及其证候的检验与评估

血虚证实验动物造模及其证候的检验与评估高维琴2006711047摘要：查阅近10年来有关中医血虚实验研究方面的医学资料，对现行各种血虚实验方法和观察指标进行了文献回顾与总结，并对其目前存在问题及未来发展作一讨论。

从而为今后实验动物证的研究提出新的思路。

关键词：血虚证；动物模型；检测指标血虚证[1]是中医的基础病证，主要表现为营血亏损。

要阐明血虚证的本质和病理生理，以及中药治疗血虚证的机理，动物实验研究是不可缺少的途径。

而要进行实验研究，首先必须有一个标准化的血虚证动物模型，这是中医药现代化研究的重要环节。

许多科研工作者在这方面做了探索和努力，然而至今尚无统一的造模规范程序和公认指标。

近年来，随着对血虚证研究的不断深入，对血虚证动物模型的研究也有新的进展。

尽管动物模型在当前还不能准确反映人体血虚证的全部实质，但作为替代实验对象，已在血虚证发病机制探讨及中药治疗研究等方面发挥了重要作用。

现对目前所已有多种血虚证动物模型制作方法，其特点及检测指标作一总述。

1中医对血虚证的认识中医理论认为，血虚多因失血过多，血液生化之源不足，或因瘀血阻滞，新血不生等原因引起。

临床表现为面色苍白或萎黄、皮肤毛发枯黄、唇舌及指甲无华、头晕、心悸失眠、手脚发麻、脉细弱无力等。

祖国医学所指血虚内涵丰富，从病因、临床特点与现代医学的贫血有密切的关系[2]。

现代医学中贫血包括低增生性（再生障碍性贫血、骨髓病性贫血）、红细胞大量破坏或丢失（溶血性贫血和失血性贫血）、成熟异常（缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、中海贫血和铁幼粒贫血等）。

且经研究发现[3,49]，血虚证的症状在贫血患者中有较高的出现率。

因此可以借鉴现代医学对贫血的研究方法来帮助建立中医血虚证的动物模型、检测指标。

2血虚证动物模型血虚证动物模型一般用大鼠、小鼠、家兔等制备。

2.1失血性血虚证动物模型2.1.1一般制备方法小鼠，体重20～22g，尾部放血0.5ml／只，失血后24h左右即可；大鼠，体重180～200g，尾部放血1.5～2ml／只，隔日1次，连续5次；家兔放血占全血量30%，狗按40ml/kg放血，可反复几次，即可造成失血性贫血血虚动物模型[4]。

本类模型多为急性失血性血虚证，其制作思路不甚符合中医的生理病机，不能够充分反应中医的血虚证特点，不是中医血虚证的较好造模选择。

目前，多采用放血的同时结合其他方法制备慢性失血性血虚证动物模型。

2.1.2放血加适当限食方法欧敏等[5]每次由兔耳中央动脉、静脉及耳缘静脉放血，放血量为全身血容量的10％，隔日1次，共7次。

自造模之日起，家兔改为半量喂养。

桂蜀华[6]等采用每日小鼠尾部放血25滴，同时配合喂养低营养精面粉。

通过对血红蛋白的动态监测，证实第3周小鼠血红蛋白显著降低，停止放血后，继续喂精面粉7d，血红蛋白维持在原有水平不再回升。

2.1.3综合放血法梁毅等[7]采用慢性放血配合饥饿、疲劳法，制作出复合血虚证小鼠模型。

具体方法：放血。

由眼眶后静脉丛放血6～8滴（约0.5m1），隔日1次。

直至模型成功。

控制饮食。

自造模之日起改变其正常饮食量，控制在每日50g／kg体重，自由饮水。

劳倦。

小鼠每天在温水池中强迫游泳2次，每次游泳时间不定，以即将下沉为限，持续15～20d。

一般在造模第15天起显现血虚证症状体征。

失血法方法简单，指标明确，不需特殊设备，可有效降低外周血中全血细胞数量，但放血量难以精确控制，模型间差别较大。

着眼于直接造成外周血中的细胞数量减少，对机体造血系统功能的影响不大。

2.2化学损伤性血虚证动物模型2.2.1溶血性血虚证乙酰苯肼（APH）是一种强氧化剂，对红细胞（RBC）有缓慢的进行性氧化损伤作用，突出表现在干扰RBC内葡萄糖-6磷酸脱氢酶（G-6-PD），使RBC 易于崩解而出现溶血性贫血。

制备方法：选用Wistar大鼠，皮下注射2％APH生理盐水溶液，剂量为10ml ／kg体重。

实验分一次性给药和实验第1、4、7天3次给药两种，后者第2、3次给药剂量减半。

补血中药可防治和逆转由APH所致血虚证[8]。

小鼠皮下注射2%乙酰苯肼0.3ml/只，共2次；或在1、4、7天皮下注射乙酰苯肼0.2g/kg、0.1g/kg、0.1g/kg，第9天造成模型；或于第3天皮下注射乙酰苯肼0.2g/kg，第7天造成模型。

大鼠于第1、4天皮下注射乙酰苯肼0.16g/kg、0.08g/kg，8天造成模型，或两次剂量均为0.2g/kg，10天造成模型[4]。

溶血性血虚操作较失血性血虚更为方便，但由于红细胞变形及碎片的干扰，镜检计数较困难，以红细胞压积法代替镜检计数较为准确。

着眼于直接造成外周血中的细胞数量减少，对机体造血系统功能的影响不大。

2.2.2骨髓抑制性血虚证环磷酰胺（CTX）是常用的抗肿瘤药物和免疫抑制剂，是细胞毒制剂，其作用机制是抑制骨髓功能，使造血细胞生成减少。

小鼠以CTX100mg／kg体重腹腔注射1次，4天后外周血白细胞数明显下降。

大鼠以CTX灌胃，首次60mg／kg体重，1周后改用20mg/kg体重，3～4天1次，共2次；用30mg／kg体重，3～4天1次，共2次；大鼠以CTX静脉注射，第一周10mg ／kg体重，给药2次，第二周15mg／kg体重，给药1次，均可形成白细胞减少模型[9]。

此种造模方法简单易行，用量及时间可灵活掌握。

但其对红细胞作用不如对白细胞明显，且持续时间较短，如果受试药物显效较慢，模型动物血象即自然恢复，甚至出现反跳现象[10]。

丝裂霉素应用法:丝裂霉素是抗生素类广谱抗肿瘤，可抑制DNA复制，不良反应为骨髓抑制，以白细胞和血小板下降明显。

马里兰应用法:又名百消安，属磺酸酯类，在体内解离后起烷化作用，小剂量即可明显抑制粒细胞生成，剂量提高可抑制全血象。

顺铂致大鼠贫血模型:顺铂是常用的金属铂的络合物，为广谱抗肿瘤药，它能与DNA结合形成交叉键，防止其复制，高剂量时亦能阻止RNA 和蛋白质的合成，可骨髓抑制[4]。

2.2.3复合血虚证模型目前，化学损伤模型还采用APH与CTX联合使用的复合血虚证模型。

采用分次给药法:环磷酰胺总剂量为160mg/kg与乙酰苯肼总剂量为60mg/kg。

分别于第一天，第四天皮下注射乙酰苯肼20mg/kg、40mg/kg，第四天起，每日腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，连续4日。

模型小鼠在注射后第4天即出体温显著降低，游泳时间缩短、血象异常的表现。

用当归补血汤能减轻骨髓细胞超微结构的损伤，显著增加血虚模型小鼠的红细胞、白细胞数，降低网织红细胞在外周血红细胞中过高的比例[10]。

袁久荣[11]等于造模第1天和第4天分别给予小鼠CTX60mg／kg体重，第4天和第7天分别给予APH0．1mg／kg体重制备血虚证模型，造模后第5天，小鼠出现懒动、竖毛、少食、体重下降、尾色苍白晦暗等现象。

造模后第11天模型小鼠外周血红细胞计数、血红蛋白量、白细胞数等均显著降低。

给予补血中药方剂的小鼠各项指标均显著高于模型小鼠。

此种造模方法与目前常用的血虚模型相比，从双重环节造成动物血虚，使模型动物的病理、生理变化不再局限于某一方面。

采用此方法造模，模型动物存活率较高，血虚状态的持续时间相对较长[12]。

2.3放射性损伤血虚证动物模型60Co射线等照射动物全身可使动物造血干细胞和祖细胞减少，骨髓造血机能受到抑制，从而使全血细胞下降，这种血虚类似临床上的再生障碍性贫血。

在以往的文献报导中[13]，常用的骨髓抑制性贫血小鼠模型的造模方法常用的主要剂量从7.5Gy～2Gy不等单纯的60co照射，高、中、低剂量组均能使全血细胞数和骨髓有核细胞数下降，高剂量组死亡率高，低剂量组自愈倾向明显，中剂量组虽避免了上两种缺陷，但粒系下降明显，红系和血小板下降不很理想[14]。

造模效果明显，但需特殊设备，且照射量的控制有一定难度，过小达不到损伤要求，偏大又会导致动物死亡，有时药物的作用难以观察。

2.3.1复合造模陈志伟[15]通过正常组、单纯照射组、单纯环磷酰胺注射组、照射加环磷酰胺注射组和照射加环磷酰胺加氯霉素注射组等复合造模比较骨髓造血情况，以期建立适用疗效观察的骨髓抑制性贫血小鼠模型。

结果根据死亡率和全血细胞数分析发现，复合造模照射加环磷酰胺组的效果最为突出。

方法：照射后给予环磷酰胺注射3d。

尤以2Gy+50mg环磷酰胺组效果最佳。

复合造模全血各系细胞数全面下降，模型稳定，复合造模的优势在于更符合骨髓抑制的临床表现：全血下降，骨髓有核细胞明显减少。

辐射和化疗造成骨髓抑制的机理不同：放射线直接损害干细胞和骨髓微环境，一定剂量后能造成骨髓抑制，对三系尤其对粒系造血影响明显。

细胞周期非特异性烷化剂环磷酰胺能通过烃化作用直接破坏DNA并阻止其复制，主要作用是抑制骨髓，引起细胞下降，对粒细胞和红系的影响非常明显，对血小板作用较轻。

复合造模的药效叠加造成第3天起全血下降，并且可持续一周以上，该法操作简便，复制周期短，成功率高的优点，是观察药物对骨髓抑制作用比较理想的动物模型[14,15]。

2.4免疫介导型血虚证动物模型2.4.1淋巴细胞输注介导动物模型建立机理：先使模型动物免疫功能严重受损，再输人一些特定的免疫活性细胞。

这些细胞在宿主体内生存，使宿主出现造血抑制，引起全血细胞减少。

可能是T 细胞通过细胞毒性及其释放的抑制性细胞因子，直接抑制造血或经凋亡导致骨髓衰竭。

一般方法为[16]：取DBA／2小鼠，断颈处死，95％乙醇浸泡消毒后，无菌条件下取出胸腺及颈、腋下、腹股沟淋巴结，加RPMI1640培养液，除去表面血污及黏附的结缔组织后，制成单细胞悬液，细胞计数，调节细胞浓度为1×106／ml，其胸腺细胞与淋巴结细胞比为1:2，并鉴定细胞活性应在95％以上。

Balb／c小鼠经X射线6.0Gy／3min亚致死剂量照射后1--4h内，立即经尾静脉输入上述细胞悬液，每只0．2ml。

但由于模型小鼠在短时间就全部死亡，推测由于射线剂量过大，故现常用5.5Gy的剂量处理小鼠。

实验表明[7,17]，采用免疫介导法复制的小鼠再障模型均在11～14天表现为皮毛枯搞、唇色眼睑苍白、拱背消瘦等中医血虚证临床特点，以及全血细胞减少、骨髓有核细胞下降等“髓不生血”的病理特点。

将正常亲代小鼠的淋巴细胞输注到杂交第一代小鼠体内也可以诱导AA，经过和未经过非致死剂量照射的子代小鼠会在2～3个星期内发生致命性的全血细胞减少。

但经过照射所建立的模型更加符合人类AA的发病特点[18,19]。

此类模型具有复制成功率高、稳定性好的特点。

并且还能和人类AA表现出相似的病理生理过程，使得研究者可以动态观察病情发展，更好地了解发病机制制作复杂，条件要求高。

2.4.2病毒感染介导动物模型建立持续的病毒感染可以使得机体免疫系统在清除病毒过程中发生异常而导致骨髓的衰竭。