pMD18-T Vector

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●制品说明1

●制品内容1

●保存1

●纯度1

●用途1

●pMD18-T Vector的结构 1

●实验操作 2

■Control DNA片段的克隆实验2

■一般DNA片段的克隆实验2

●使用注意 3

●Q&A 3

●制品说明

pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。它是TaKaRa公司经过长年的研究开发，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。因大部分

耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

本制品是以最为常用的pUC18载体为基础研制而成，所以它具有同pUC18载体完全相同的功能。此外，本制品中的高效连接液Ligation Solution I可以在极短的时间内（30分钟～1小时）完成连接反应，大大地方便了实验操作。另外，本制品中还含有Control Insert（500 bp），可用于Control反应。

●制品内容

pMD18-T Vector（50 ng/μl）20 μl×1支

Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支

Ligation Solution I 30 μl×5支*

* 使用时请于冰中融解。

●保存：-20℃

●纯度

■Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。

■Control Insert经克隆后，用双脱氧测序法确认多克隆酶切位点及T碱基的存在。

●用途

■进行TA克隆，克隆PCR产物。

■对克隆后的PCR产物须用M13 Primers进行DNA测序。

●pMD18-T Vector的结构

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●实验操作

■Control DNA片段的克隆实验

A）操作方法

1）在微型离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。

pMD18-T Vector*1 1 μl

Control Insert DNA*2 1 μl

dH2O 3 μl

2）加入5 μl（等量）的Ligation Solution I。

3）16℃反应30分钟（过夜反应也不影响效率）。

4）全量（10 μl）转化至JM109等感受态细胞（100μl）中。

5）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

6）挑选白色菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小。

B）结果

使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108 cfu/μg pUC118 DNA。

* 效率是指白色菌落中的目的DNA I nsert片段的连入效率。

■一般DNA片段的克隆实验

1）在微型离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。

pMD18-T Vector*1 1 μl

Insert DNA*3 0.1 pmol～0.3 pmol

dH2O up to 5 μl

2）加入5 μl（等量）的Ligation Solution I。

3）16℃反应30分钟（过夜反应也不影响效率）。

4）全量（10μl）转化至JM109等感受态细胞（100 μl）中。

5）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。

6）挑选白色菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小。

*1 pMD18-T Vector的使用量

取0.5 μl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要使用T载体的量。pMD18-T Vector

1 μl（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmo l。

*2 Control I nsert DNA

Control I nsert DNA为500 bp的3′末端带有A碱基的PCR产物，Control I nsert DNA 1 μl（50 ng）的摩尔数约为0.15 pmo l。

*3 I nsert DNA的使用量

在进行克隆时，Vector DNA和I nsert DNA的摩尔比一般为：1 ：2～10。

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●使用注意

1）Ligation Solution I请于冰中融解。

2）克隆时使用的Insert DNA片段（PCR产物）尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA

（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

3）按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。

4）连接反应请在16℃下进行，温度升高（>26℃）较难形成环状DNA。

5）连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。

6）当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀纯化DNA后再进行转化。

●Q&A

Q-1 pMD18-T Vector转化时须使用何种感受态细胞？

A-1 本制品的载体来源于pUC18载体，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可使用，如：JM109等。

Q-2 怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率？

A-2 1. 纯化PCR产物。切胶回收的PCR片段最好。此时可使用TaKaRa Code No. D301或DV805A 制品。

2. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆

效率（连接效率与转化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的连接液进行转化时，建

议采用电转化方法。

Q-3 PCR产物难以插入载体，为什么？

A-3 1. 确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3′端是否附加了A。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端，如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶（TaKaRa Code No. DR005）等

扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆；PCR产物保存时间不要过长，长时间保存的PCR

产物会脱去末端的“A”碱基。

2．PCR产物中短片段杂质DNA太多，这时应切胶回收纯化DNA片段，回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。

3．确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108cfu/μg pUC118 DNA。

4.确认Ligation Solution I的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低Ligation Solution I的

连接效率。

5. 确认抗生素的浓度是否过大。

6. 最好使用新配制的平板培养基。

Q-4 转化后的菌落全为蓝色（或淡蓝色），为什么？

A-4 插入的PCR片段较短（小于500 bp），且插入片段没有影响lacZ基因的读框时，平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。

Q-5 欲对TA克隆产物进行测序时，可使用何种引物？

A-5 本制品的载体来源于pUC18载体。因此，用于pUC18载体测序的引物都可以使用。