高效液相色谱_电喷雾离子阱飞行时间质谱法鉴定乙酰甲喹及其代谢物_刘迎春

本实验室采用高效液相色谱串联线性离子阱质谱 、 高效 其体内代谢产物的识别和鉴定鲜有报道 。鉴此， 液相色谱串联离子阱飞行时间高分辨质谱等技术 ， 对鸡口服给药乙酰甲喹后的代谢物进行分离鉴定 ， 同 时借鉴喹乙醇、 卡巴氧、 喹赛多、 喹烯酮等同类化合物的代谢规律及其检测方法 谢物的可能结构， 并通过化学合成进一步验证了有关代谢物结构 。
1
引
言
2N1 ， N4 乙酰甲喹（ Mequindox） ， 又名痢菌净， 化学名为 3甲基乙酰基喹啉二氧化物， 为卡巴氧 ［1 ］ ［2 ］ 类似物，是由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所合成的兽用药 。乙酰甲喹对仔猪黄、 白痢 、 猪 痢疾
［3 ］
及鸭大肠杆菌病均具有较好的临床疗效 。 另外， 由于其价格低廉， 被广泛用于养殖业疾病的防
13 H） ，δ 2. 82 （ 3H，s， 13H） ，δ 1. 62 （ 3H，d，J = 5. 2 Hz，12H） ， CNMR δ 5. 83 （ 1H，q，J = 4. 4 Hz 11（ 100 M， CD3 OD） ： δ 148. 37 （ 2C） ， C） ， C） ， C） ， C） ， δ 144. 04 （ 3δ 137. 98 （ 9δ 137. 89 （ 10δ 133. 18 （ 8-
C ） ，δ 120. 89 （ 7C ） ，δ 120. 71 （ 6C ） ，δ 65. 99 （ 11C ） ，δ 19. 75 （ 13C ） ，δ 14. 29 （ 12C） ； δ 132. 86 （ 5+ ESIMS： m / z 221 ［M + H］ 。 HNMR（ 400 M，CD3 OD） ： δ 8. 58 （ 1H，m， 8H） ，δ 8. 08 （ 1H，m，5H ） ，δ 7. 79 （ 1H，m， 7H） ，δ 7. 73 （ 1H，m，6H ） ，δ 5. 14 （ 1H，q，J = 4. 4 Hz 11H ） ，δ 2. 65 （ 3H，s，13H） ， + 12H） ；ESIMS： m / z 205 ［M + H］ 。 δ 1. 53 （ 3H，d，J = 4. 0 Hz， （ 3 ） 代谢物 M3
（ 1H，dd，J = 5. 2 Hz，J = 0. 8 Hz， 5H） ，δ 7. 88 （ 1H，m， 7H） ，δ 7. 81 （ 1H，m， 6H） ，δ 2. 89 （ 3H，s， 12H） ， δ 2. 78 （ 3H， s， 13H ） ；13 CNMR （ 100 M， CD3 OD ） ： δ 24. 23 （ 13C ） ， 27. 67 （ 12C） ，
［10 ～ 16 ］
， 推测乙酰甲喹代
2
2.Hale Waihona Puke Baidu1
实验部分
仪器与试剂
LC20AD 流 高效液相色谱串联离子阱飞行时间质谱仪 （ 日本岛津公司 ） ， 包括高效液相色谱系统， SIL20AC 自动进样器， DGU20A3 脱气装置， SPDM20A 二极管检测器， CBM20A 信号处理 动相输送泵， CTO20AC 柱式加热器； 高效液相色谱系统， 电喷雾线性离子阱质谱， 配 Survey 液相操作系统 （ 美国 Thermo Fisher Scientific 公司 ） ； 高效液相色谱仪 （ 美国戴安公司 ） ； Bruker Avance 400 型超导核磁仪 （ 瑞 TMS 为内标。 乙酰甲喹 （ 含量 99. 5% ， 典 Bruker 公司） ， 批号 20060801 ， 江苏天成动物保健品有限公 司） ；代谢物 M1 ，M2 ，M3 ，M4 对照品 （ 广东省兽药研制与安全评价重点实验室合成 ） ； 甲醇 （ 色谱纯，
45 ～ 57 min， 60% B； 57 ～ 60 min， 60% ～ 20% B； 60 ～ 65 min， 20% B。 流速 1 mL / min， 检测波长 241 nm。 2. 2. 2
10% ～ 40% B ；7 ～ 10 min， 40% ～ 90% B ； 10 ～ 12 min， 90% B ；12 ～ 13 min， 90% ～ 10% B ；13 ～ 18 min， 10% B 。流速：0. 25 mL / min。 电 喷 雾 离 子 化 源， 正 离 子 模 式 检 测， 检 测 电 压： 4. 5 kV； 毛 细 管 电 压： 5. 0 V；管透镜电压：85. 0 V；鞘气 （ N2 ） ： 流速 40 个单位； 辅气 （ N2 ） ：5. 0 个单位； 多级质谱相对碰撞能 量：35% ；扫描范围：m / z 100 ～ 500 。 2. 2. 3 高 效 液 相 色 谱ESIIT / TOF MS ） 条 件 电 喷 雾离 子 阱 / 飞 行 时 间 串 联 质 谱 （ LCTM
*
（ 华南农业大学兽医学院，广东省兽药研制与安全评价重点实验室，广州 510642 ） 摘 要 ESI / LTQ） 、 利用高效液相色谱分离 、 电喷雾线性离子阱质谱法（ LC电喷雾离子阱 / 飞行时间串联质
ESI / ITTOF ） 鉴 定 鸡 血 浆 中 乙 酰 甲 喹 及 其 代 谢 物 的 结 构 。 分 别 采 用 Hypersil Gold 和 Symmetry 谱法（ LCShield TM 色谱柱， 以含有 0. 01% 甲酸水溶液（ A） 和甲醇（ B） 为流动相， 梯度洗脱， 电喷雾离子源（ ESI ） 正离子模 式进行检测。鸡口服给药乙酰甲喹（ 20 mg / kg） 后， 翅下静脉采血， 待分析血浆用乙腈乙酸乙酯（ 3∶ 2 ，V / V ） 混 合液提取， 吹干。残渣用 30% 甲醇水溶液复溶， 上机检测。用 Shimadzu′s Composition 分子预测软件推测分子 Xcalibur 2. 0. 7 软件分析线性离子阱质谱仪测得质谱图 。鉴定出 5 种主要代谢物， 离子及其子离子质量， 分别 2（ 1N1 ， N4 32（ 1N4 甲基羟 基） 乙 基喹 啉二 氧 化 物 （ M1 ） 、 甲 基羟 基） 乙 基喹 啉一氧化物 为 3（ M2 ） 、 32N4 322（ 1甲基乙酰基喹啉一氧化物 （ M3 ） 、 甲基乙酰基喹啉 （ M4 ） 和 3羟甲基羟基） 乙 N1 ， N4 喹啉二氧化物 （ M5 ） 。同时根据推测结果对代谢物 M1 ～ M4 进行化学合成， 利用合成代谢物的 基谱学测定数据进一步确证推测代谢物的化学结构 。本实验为研究乙酰甲喹体内代谢产物及代谢机理提供了 便捷而有效的模式。 关键词 乙酰甲喹； 代谢物； 高效液相色谱电喷雾电离离子阱飞行时间串联质谱； 结构鉴定
1
（ 2 ） 代谢物 M2
1
HNMR（ 400 M，CD3 OD） ： δ 8. 52 （ 1H，m， 8H） ，δ 8. 17 （ 1H，m，5H ） ，δ 7. 90
（ 2H，m， 6， 7H ） ，δ 2. 76 （ 6H，s，12 ， 13H ） ；13 CNMR （ 100 M，CD3 OD ） ： δ 13. 95 （ 13C ） ，δ 27. 93 （ 12C ） ，δ 119. 55 （ 3C ） ，δ 131. 78 （ 6C ） ， δ 132. 56 （ 7C ） ， δ 133. 45 （ 5C ） ， δ 137. 93 （ 8C），
第 38 卷 2010 年 1 月
分析化学 （ FENXI HUAXUE）
研究报告
第1 期 82 ～ 86
Chinese Journal of Analytical Chemistry
高效液相色谱 -电喷雾离子阱飞行时间质谱法 鉴定乙酰甲喹及其代谢物
刘迎春 司红彬 贺利民 丁焕中 黄显会 陈建新 陈杖榴 曾振灵
［4 ， 5］
。外 由于对乙酰甲喹药理学性质不太了解 ， 导致中毒事件时有发生 治。但是在养殖户使用过程中， 源性化学物质导致动物中毒常与其代谢物有关 。目前， 对乙酰甲喹的研究仅限于重离子辐照乙酰甲喹 对其生物活性的影响
［6 ］ ， 饲料中乙酰甲喹含量的测定， 乙酰甲喹在猪肌肉中的检测方法 ， 在绵羊、 家 ［7 ， 8］ ［9 ］ 以及乙酰甲喹与血清白蛋白的结合 等方面， 对于动物给药乙酰甲喹后在 兔体内药物代谢动力学 ［1 ］
20090716 收稿；20090916 接受 本文系国家重点基础研究计划（ 973 ） 项目（ No. 2009CB118805 ） 资助 * Email： zlzeng@ scau. edu. cn
第1 期
刘迎春等：高效液相色谱电喷雾离子阱飞行时间质谱法鉴定乙酰甲喹及其代谢物
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Sigma 公司） ；乙酸乙酯、 乙腈（ 分析纯， 国药集团上海化学试剂厂） 。 2. 2 2. 2. 1 色谱质谱条件 5 μm） ， 高效液相色谱条件 Hypersil BDS C18 色谱柱（ 250 mm × 4. 6 mm， 柱温： 30 ℃ ； 流动相： 甲醇（ B ） / 水（ 含 0. 01% 甲酸） （ A ） ，梯度洗脱： 0 ～ 40 min，20% ～ 35% B； 40 ～ 45 min，35% ～ 60% B； ESILTQ MS ） 条件 Hypersil Gold C18 色谱柱 高效液相色谱电喷雾线性离子阱质谱 （ LC（ 100 mm × 2. 1 mm， 5 μm） ，柱 温：40 ℃ ；流动相：甲醇（ B ） / 水（ 含 0. 01% 甲酸 ） ， 梯度洗脱：0 ～ 7 min，
+ C ） ，δ 143. 20 （ 9C ） ，δ 152. 03 （ 2C ） ，δ 201. 22 （ 11C ） ； ESIMS： m / z 203 ［M + H］ 。 δ 141. 84 （ 101 （ 4 ） 代谢物 M4 HNMR（ 400 M，CD3 OD） ： δ 8. 12 （ 1H，dd，J = 5. 2 Hz，J = 0. 8 Hz， 8H） ，δ 7. 99
3
3. 1
1
结果和讨论
合成代谢物谱学测定结果
乙酰甲喹及体内推测代谢物 （ M1 ～ M5 ） 结构如图 1 所示。 对化学合成代谢物 （ M1 ～ M4 ） 分别进 13 NMR、 CNMR 及 LCESI / LTQMS 质谱解析。 行 H1 （ 1 ） 代谢物 M1 HNMR （ 400 M，CD3 OD ） ： δ 8. 55 （ 2H，m，5 ， 8H ） ，δ 7. 93 （ 2H，m，6 ， 7H） ，
－4 －2 化气流速： 1. 5 L / min； 干燥气流速：4. 0 L / min； TOF 真空度： 1. 5 × 10 Pa； IT 真空度： 1. 7 × 10 Pa； 诱导解离碰撞时间： 30 ms； 多级 MS 碰撞能量： 50% ； 精确质量数用三氟醋酸钠校准； 干燥气温度：
35 ℃ ，干燥气流速： 10 L / min，毛细管电压： 4 kV，裂解电压： 100 V； 扫描范围： m / z 150 ～ 400 。 2. 3 样品采集与处理 500 白羽鸡（ 正大康地 （ 东莞 ） 有限公司 ） ， 2. 0 ～ 2. 5 ㎏， 实验动物为科宝饲养至 4 周龄， 实验前鸡 10 ， 15 ， 30 ， 45 min 和 1 ， 2， 4， 6， 8， 拒食 12 h， 正常饮水， 口服灌药 20 mg / kg 体重。给药后分别于 0 ， 10 h 采血， 每次 2 mL， 于加有抗凝剂离心管内并离心， 血浆样品 － 20 ℃ 保存， 待测。 用微量移液枪量取 血浆样品 1 mL 于 15 mL 离心管内， 加 6 mL 乙 腈乙 酸 乙 酯 （ 3 ∶ 2 ，V / V ） 混 合 液 漩 涡、 震 荡 30 min， 6000 r / min 离心 10 min， 取有机相于另一离心管， 重复提取， 合并有机相， 于 45 ℃ 下氮气吹干， 加 1 mL 30% 甲醇水溶液溶解， 离心后取上清液过 0. 22 μm 滤膜， 上机检测。
Symmetry
Shield 色谱柱（ 50 mm × 2. 1 mm， 3. 5 μm） ；柱 温： 40 ℃ ； 流动相： 甲醇 （ B ） / 水 （ 含 0. 01% 甲酸 ） ，梯 度洗脱同方法 2. 2. 2 ； 流速： 0. 2 mL / min。电喷雾离子化源，正离子模式检测，检测电压： 1. 6 kV； 雾