第十章蛋白质和氨基酸测定
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二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随 之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
10
为加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：
<1>硫酸钾，增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分解，它与 硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，纯硫酸沸点 340℃，加硫酸钾（1689 ℃ ）后可以提高至400℃以上。
原因主要在于随着消化过程中硫酸不断的被分解，水分不 断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高。
K2SO4 +H2SO4 =2KHSO4
△
2KHSO4 ＝ K2SO4+H2O↑+SO3 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引 起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失：
△
（NH4）2SO4
NH3↑+（NH4）HSO4
目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基 酸主要是其中的20种。
在构成构成蛋白质的氨基酸中8种氨基酸在人体中不能合 成，必须依靠从食品摄入，故被称为必需氨基酸，它们对 人体有着极其重要的生理功能。
亮氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 苯丙氨酸 蛋氨酸 苏氨酸 色氨酸 缬氨酸
Leu Iso
Lys Phe
动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法,可应用于各类食品 中蛋白质含量的测定。
一般来说，蛋白质的平均含氮量为16%，在用凯氏定氮法 定量蛋白质时，将测得的总氮乘上蛋白质的换算系数 K=6.25即为该物质的蛋白质含量。
在食品中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化 合物（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、 卟啉和含氮的色素）。
贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存 在的情况下消化不完全而造成氮损失。 ③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷 凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促 进其消化完全。
17
④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产大量 泡沫，在开始消化时应用小火加热，并时时摇 动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡 剂。
低，漂洗容易。灵敏度比氨基黑高五
倍,微量蛋白染色。
5
6
第三节 蛋白质的定量测定
蛋白质的测定方法分为两大类： ➢ 一类是利用蛋白质的共性，即利用含氮量，肽键
和折射率等测定蛋白质含量； ➢ 一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性
基团和芳香基团测定蛋白质含量。
7
一、凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自
9
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定
⑴ 消化 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝ （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
浓硫酸的脱水性：98%，有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸的氧化性：碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫。
2H2SO4 +C＝CO2+2SO2+2H2O
Байду номын сангаас
除硫酸铜外还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、 二氧化钛（偏低）等，应用最广泛的是硫酸铜。
12
<3> 氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物 氧化速度。但要防止氨进一步氧化为氮。一般 说来，若有足够的其他还原剂，如碳，则添加 氧化剂不致使测定结果偏低。目前使用双氧水 较多，但必须注意须待消化液完全冷却后再加 入。
第十章 蛋白质和氨基酸的测定
第一节 概述 第二节 蛋白质定性测定 第三节 蛋白质定量测定 第四节 氨基酸定性测定 第五节 氨基酸定量测定 第六节 氨基酸的分离与测定
1
第一节 概述
一. 概况
蛋白质作用：①生命的物质基础；②构成生物体 细胞组织的重要成分；③生物体发育及修补组织 的原料。人体内的酸、碱及水分平衡，遗传信息 的传递，物质代谢及转运都与蛋白质有关。 蛋白质除了保证食品的营养价值外，在决定食品 的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。 一个食品的营养高低，主要看蛋白质的高低。
2
1 . 蛋白质组成
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体 分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化 合物，它主要组成元素是C 、H、O、N、S、P。另外还 有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。
元素 百分比%
C HO N S 50 7 23 16 0—3
P 0—3
3
2. 氨基酸组成
蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米=6.25， 小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70
注意：当测定的样品其含氮的系数与100/16相差较大时， 采用6.25将会引起显著的偏差。
8
（一）常量凯氏定氮法 1. 原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使 蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸 出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸 铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。再用H3BO3吸收后 再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计 算出蛋白质的含量。
13
仪器：凯氏消 化装置。要防 止爆沸。
14
2. 蒸馏 消化液 + 40% 氢氧化钠（过 量）加热蒸馏， 放出氨气。
15
3. 吸收与滴定
硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示 剂变色反应，它有吸收氨的作用。
<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示 剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指 示剂，国标用亚甲基兰+甲基红）。
11
△
2（NH4）HSO4
NH3↑+SO3+H2O
也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不
如硫酸钾。
<2> 硫酸铜，催化剂，消化终点指示剂，做蒸馏
时碱性指示剂。硫酸铜的作用机理如下：
C+ 2CuSO4 △ Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2Ｈ2SO4
2CuSO4 +SO2+2H2O
指示剂 紫红色
绿色
淡紫红
（酸） 吸收 （碱） 滴定 （酸）
<2> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再 用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红 指示剂。（pH4.4～6.2 红 黄 ）
16
注意： ① 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ② 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘
Met Thr
Try
Val
4
第二节 蛋白质的定性测定
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。
氨基黑——酸性染料。灵敏 度较高，花费时间长。
溴酚蓝——灵敏度低，摩尔 质量低的蛋白质可能染不上 颜色。
考马斯亮蓝——有较多疏水基团和蛋
白质的疏水区有较大的亲和力通过范
德华力结合，而和凝胶基质的亲和力
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为加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：
<1>硫酸钾，增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分解，它与 硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，纯硫酸沸点 340℃，加硫酸钾（1689 ℃ ）后可以提高至400℃以上。
原因主要在于随着消化过程中硫酸不断的被分解，水分不 断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高。
K2SO4 +H2SO4 =2KHSO4
△
2KHSO4 ＝ K2SO4+H2O↑+SO3 硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引 起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失：
△
（NH4）2SO4
NH3↑+（NH4）HSO4
目前各种氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基 酸主要是其中的20种。
在构成构成蛋白质的氨基酸中8种氨基酸在人体中不能合 成，必须依靠从食品摄入，故被称为必需氨基酸，它们对 人体有着极其重要的生理功能。
亮氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 苯丙氨酸 蛋氨酸 苏氨酸 色氨酸 缬氨酸
Leu Iso
Lys Phe
动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法,可应用于各类食品 中蛋白质含量的测定。
一般来说，蛋白质的平均含氮量为16%，在用凯氏定氮法 定量蛋白质时，将测得的总氮乘上蛋白质的换算系数 K=6.25即为该物质的蛋白质含量。
在食品中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化 合物（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、 卟啉和含氮的色素）。
贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存 在的情况下消化不完全而造成氮损失。 ③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷 凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促 进其消化完全。
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④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产大量 泡沫，在开始消化时应用小火加热，并时时摇 动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡 剂。
低，漂洗容易。灵敏度比氨基黑高五
倍,微量蛋白染色。
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第三节 蛋白质的定量测定
蛋白质的测定方法分为两大类： ➢ 一类是利用蛋白质的共性，即利用含氮量，肽键
和折射率等测定蛋白质含量； ➢ 一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性
基团和芳香基团测定蛋白质含量。
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一、凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自
9
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定
⑴ 消化 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝ （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
浓硫酸的脱水性：98%，有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸的氧化性：碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫。
2H2SO4 +C＝CO2+2SO2+2H2O
Байду номын сангаас
除硫酸铜外还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、 二氧化钛（偏低）等，应用最广泛的是硫酸铜。
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<3> 氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物 氧化速度。但要防止氨进一步氧化为氮。一般 说来，若有足够的其他还原剂，如碳，则添加 氧化剂不致使测定结果偏低。目前使用双氧水 较多，但必须注意须待消化液完全冷却后再加 入。
第十章 蛋白质和氨基酸的测定
第一节 概述 第二节 蛋白质定性测定 第三节 蛋白质定量测定 第四节 氨基酸定性测定 第五节 氨基酸定量测定 第六节 氨基酸的分离与测定
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第一节 概述
一. 概况
蛋白质作用：①生命的物质基础；②构成生物体 细胞组织的重要成分；③生物体发育及修补组织 的原料。人体内的酸、碱及水分平衡，遗传信息 的传递，物质代谢及转运都与蛋白质有关。 蛋白质除了保证食品的营养价值外，在决定食品 的色、香、味及结构等特征上也起着重要的作用。 一个食品的营养高低，主要看蛋白质的高低。
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1 . 蛋白质组成
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体 分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化 合物，它主要组成元素是C 、H、O、N、S、P。另外还 有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。
元素 百分比%
C HO N S 50 7 23 16 0—3
P 0—3
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2. 氨基酸组成
蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米=6.25， 小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70
注意：当测定的样品其含氮的系数与100/16相差较大时， 采用6.25将会引起显著的偏差。
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（一）常量凯氏定氮法 1. 原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使 蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸 出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸 铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。再用H3BO3吸收后 再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计 算出蛋白质的含量。
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仪器：凯氏消 化装置。要防 止爆沸。
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2. 蒸馏 消化液 + 40% 氢氧化钠（过 量）加热蒸馏， 放出氨气。
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3. 吸收与滴定
硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示 剂变色反应，它有吸收氨的作用。
<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示 剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指 示剂，国标用亚甲基兰+甲基红）。
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△
2（NH4）HSO4
NH3↑+SO3+H2O
也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不
如硫酸钾。
<2> 硫酸铜，催化剂，消化终点指示剂，做蒸馏
时碱性指示剂。硫酸铜的作用机理如下：
C+ 2CuSO4 △ Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2Ｈ2SO4
2CuSO4 +SO2+2H2O
指示剂 紫红色
绿色
淡紫红
（酸） 吸收 （碱） 滴定 （酸）
<2> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再 用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红 指示剂。（pH4.4～6.2 红 黄 ）
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注意： ① 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ② 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘
Met Thr
Try
Val
4
第二节 蛋白质的定性测定
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。
氨基黑——酸性染料。灵敏 度较高，花费时间长。
溴酚蓝——灵敏度低，摩尔 质量低的蛋白质可能染不上 颜色。
考马斯亮蓝——有较多疏水基团和蛋
白质的疏水区有较大的亲和力通过范
德华力结合，而和凝胶基质的亲和力