如何对表达载体进行选择及读谱方法
如何对表达载体进行选择及读谱方法
目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：
（1）复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+,Kan+
（3）多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段
（4）P/E启动子/增强子
（5）Terms终止信号
（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的4点要求：
（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。
如何阅读质粒图谱
第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
（5）hygr使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
（1）启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。（2）增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。
（3）核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。
（4）转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA 的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.
原核&真核表达载体构建
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
读谱能力技巧《奏大师》技巧攻略及解析
读谱能力技巧《节奏大师》技巧攻略及解析 如何提高读谱能力来谈谈我自己地一些看法和见解.希望能够帮助到大家.有什么不对地地方还望指出.大家如果有什么好地方法和建议，也可以发表出来. 阶段一：克罗地亚狂想曲 我还记得我刚玩节奏大师时，被这首歌(4k ez)虐地好惨...尤其是中间地散点部分...而现在对于大部分玩家，这种初级地散点，应该没什么压力吧.对于新手(第一次接触音游地玩家)来说，可以选择用二、三速来玩，勤加练习练就行了文档来源网络及个人整理,勿用作商业用途阶段二：少女绮想曲/野蜂飞舞 不要问我为什么把这几首歌放在一起，我只是粗略地在节奏中把读谱能力分为三个阶段.另外，我是以歌曲中散点为主来分析地.顺便就这样谈谈我地看法.好，我们继续.我曾经听人说过，用一、二速来玩野蜂，能够提高读谱能力，我也尝试过，但没能持久下去，效果大不大就不知道了，大家可以去试试看.我练习读谱时就是努力看清每一个散点，教大家一个方法.就拿4k来说吧，把屏幕分为左右两半来看，看屏幕1/2以下地部位，努力看清每一个散点.不要因为看不清，就用手指在屏幕上瞎拍，这样是毫无用处地.久而久之，你地读谱能力会有所提高地.文档来源网络及个人整理,勿用作商业用途 阶段三：少女绮想曲 说到这一阶段，我还是先和大家讲一个我以前看过地故事吧.故事大概是这样地：一位少年学习弹钢琴，他地钢琴老师每次都给一份超出他能力地钢琴谱给他练，而且一次比一
次难.就这样练习了挺长一段时间，终于有一天，少年忍不住了，问老师为什么每次都给那么难地钢琴谱给他练，而且越来越难.老师也是不言语，拿出了给他练地第一份钢琴谱，让他弹弹看.少年就照做了，他发现这份在他当时看来是那么难地谱子现在却变得非常轻松.所以说，我们要提高读谱能力，必须要不断尝试密度更大，键位下落速度更快地歌曲来练习.还有，我们不能仅仅局限于4k，也要多玩玩5、6k.相信许多玩4k玩久了地人玩5、6k地话都会有一种驾驭不了地感觉.另外，我推荐大家也多玩玩一些和节奏类似地音游，像 o2j a mu就很不错.另外pc端音游(例如myo2,劲乐团等等)对读谱能力就是个很大地挑战，用来练习读谱能力都很不错.文档来源网络及个人整理,勿用作商业用途 更多节奏大师攻略信息还可以关注：触手TV节奏大师直播专区和触手TV节奏大师攻略视频教程专区.
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与
谈企业文化的几种载体选择
谈企业文化的几种载体选择 最近和很多企业主的一次座谈中，说起企业文化，众多管理者、决策者的一致反映是企业文化是虚无缥缈的东西，根本不是一个企业的重心。可是当我们谈到可口可乐与音乐、百事可乐和足球（体育）、力帆和足球、肯德基（麦当劳）和儿童玩具……时，很多企业主立刻产生了兴趣，也表示要建立自己的企业文化体系。那企业文化应该如何和市场接轨，如何变抽象为具体，如何选择最合适的文化载体呢？ 旅游（文化） 把企业经营和旅游结合，并且使旅游文化成为一个企业的特色，这并不是旅游公司的专利。实际上，目前企业的很多销售行为，都会自觉不自觉的和旅游靠拢，特别是购买产品中旅游大奖现象十分普遍。一般来说，销售到最终产生大奖的周期较长——这样做的好处一是对实际销售的直接刺激，又迎合了新世纪的旅游热，另外组团旅游的方式企业付出的实际成本并不高，还有就是企业实力和品牌的无形宣传。 如果把旅游作为企业文化的支撑，首先要建立全球的旅游关系网络，使组团旅游的成本降到冰点。然后在销售和服务过程中始终和旅游紧密结合，甚至旅游也是一个再次销售的过程——比如保健品行业的科普体验式营销，家电行业的工业园参观等，都是一种无形的销售方式。旅游文化的建立还有一个重要因素就是针对不同产品、不同人群的线路确立，确保旅游旺季对顾客的全心服务，使顾客在最好的季节看到最美丽的风景。 旅游文化还可以推出“故地重游”、“新婚游”、“生产基地参观”、“焦点追踪”（和重大事件结合——比如世界杯或者飞黄等事件）等项目，使企业真正成为旅游产业的代言人，长期的旅游行动对企业的宣传作用也是不言而喻的，关键是把服务做到无微不至，增强企业的知名度和美誉度。 知青（文化） 知青可以说是中国特色，也是可以借用的一股重要力量。 当年的知青如今年龄一般在50岁——60岁左右，大部分回城以后已经退休，是保健品行业、超市消费的准顾客。如何把知青文化加以发掘，是很多企业应该思考的问题。 青岛，南山百盛超市，一个面积不到3000米的小超市，按规模按位置都不占优势，竟然使沃尔玛、家乐福等企业感到无可奈何，其主要原因就是对文化的挖掘——特别是创立了堪称中国第一个“知青节”，给广大的知青一个交流的舞台，聚会的场所，许多失去音讯多年的知青在超市前抱头痛哭，同时把百倍的感谢回报给了企业，创造了中国超市的许多奇迹（包括单位面积盈利全国第一等），这就是文化的力量，策划的力量！ 中国有近千万知青，他们有知识、有阅历、有涵养，属于能够自主消费的群体，也是不可忽视的重要社会组织。如果哪个企业把知青文化做到深处，调动中国最优势的消费主题——特别是保健品医药行业，企业的发达是必然的。
原核表达载体的重要调控元件
原核表达载体的重要调控元件 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤 来源：郭庆水的日志 植物表达载体转化农杆菌操作步骤 第一部分：农杆菌介导转化水稻 1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101 2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。 3、农杆菌感受态细胞的制备： 1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。 2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min； 3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min； 5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液； 6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化； 制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。 4、DNA直接转化农杆菌： 1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min； 2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min； 3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr； 4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。 （pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 5、重组农杆菌鉴定： 1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str） 2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。 3）质粒酶切或PCR鉴定。 6、三亲交配法： 参考一： 1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养； （pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养； 3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养； 4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养； 5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜； 6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1
常见仪器分析方法的缩写、谱图和功能说明
常见仪器分析方法得缩写、谱图与功能说明
A AAS 原子吸收光谱法 AＥS 原子发射光谱法 AFS 原子荧光光谱法 ＡＳV 阳极溶出伏安法?ＡＴR 衰减全反射法?AＵＥＳ俄歇电子能谱法 C CEP 毛细管电泳法?CGC毛细管气相色谱法?CIMS 化学电离质谱法 CＩP 毛细管等速电泳法 CLＣ毛细管液相色谱法 CSＦC 毛细管超临界流体色谱法?CSＦE 毛细管超临界流体萃取法?CSV 阴极溶出伏安法?CZEP 毛细管区带电泳法
D DDＴA导数差热分析法?ＤIＡ注入量焓测定法 ＤPASV 差示脉冲阳极溶出伏安法 DPＣSＶ差示脉冲阴极溶出伏安法 DPP 差示脉冲极谱法?DPSV 差示脉冲溶出伏安法?DPVA差示脉冲伏安法?DSC 差示扫描量热法 ＤＴＡ差热分析法 ＤTG差热重量分析法 E?ＥAＡＳ电热或石墨炉原子吸收光谱法 EＴA 酶免疫测定法?EIＭS 电子碰撞质谱法 ELISＡ酶标记免疫吸附测定法 EMAP 电子显微放射自显影法?ＥMIＴ酶发大免疫测定法?ＥPＭA 电子探针Ｘ射线微量分析法 ESCA 化学分析用电子能谱学法 EＳP 萃取分光光度法 F?FAＡS 火焰原子吸收光谱法 FＡＢMS 快速原子轰击质谱法 ＦＡES 火焰原子发射光谱法 ＦDMS 场解析质谱法 FＩA流动注射分析法 FIMS场电离质谱法?FNAA 快中心活化分析法?FT-IＲ傅里叶变换红外光谱法 ＦＴ-NＭR傅里叶变换核磁共振谱法?FT—MＳ傅里叶变换质谱法?GC 气相色谱法?ＧＣ—IR 气相色谱—红外光谱法?GＣ—MS气相色谱－质谱法?ＧD-AＡS 辉光放电原子吸收光谱法?ＧD-AES 辉光放电原子发射光谱法
载体选择
1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 & Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。 保存液: TE Buffer TE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA 用途: 克隆外源DNA片断. 进行基因表达. 使用M13、T7和T3引物进行测序.
想和大家讨论讨论原核表达载体
【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体 原核表达载体，如pet系列，型号从小到大，那么多，往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。 希望下面的讨论分系列进行，如pet系列、pgex系列等 这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍，只要你耐心的看完，相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充 pET，原核表达金标准（转） pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，
教你如何看乐谱(建议收藏)
教你如何看乐谱（建议收藏） 多尔音乐学院,中国首家在线音乐学院本文较长建议收藏后观看早在几千年前人们就开始用笔记录音乐了，即使是我们现在使用的乐谱也有超过三百年的历史。在乐谱中，我们用各种符号将声音具体化，小到音高、音长和节拍，大到音质甚至是特效。这篇文章会告诉你一些基本知识和识谱技巧，有助你以后学习更多的乐理知识。那么如何认识乐谱？小编将用3种方法分别是基础知识，节拍，节奏来讲解，大家可以优先观看自己熟悉的一样先下手！认识乐谱方法之1：基础知识步骤1：基础知识什么是五线谱？五线谱是学习音乐的基础，事实上也是识谱必学的知识。五线谱由一条条横线构成，我们所使用的音乐符号以及从事的音乐活动等都是在它的基础上建立的。。 五线谱由五条平行的“横线”和四条平行的“间”组成。我们从下到上，从小到大分别给“线”和“间”编上号。步骤2：我们首先学习高音谱号。谱号位于五线谱的开头，表示演奏的音高的一个大致范围。高音人声和高音乐器的五线谱都以高音谱号开头。后面我们也主要使用高音谱表作示例。高音谱号又名G谱号，来自于花体的拉丁字母G。只要记住谱号中间有一根盘旋而上的线的便是高音谱号。高音谱表的每条线和间都有不同的含义。五条横线从下到上依次代表五
个音：E G B D F。四条间（线与线之间的空隙）从下到上依次代表四个音：F A C E。要把全部音符记下来看似很难，但我们可以使用一些口诀。比如用“儿歌不断放”来记线上的音。用“FACE”这个英文单词来记间上的音。步骤3：低音谱号又称F谱号。用于低音部分的乐谱。钢琴的左手区域、低音吉他和长号就适用于这一类。F谱号来源于花体的字母F，它旁边的两点分别位于第四线两边。低音谱表和高音谱表上的线、间的音高不同。五根线从下到上依次代表G B D F A（根本的方案）。四条间从下到上依次代表A C E G（爱吃鹅肝）。步骤4：五线谱中的音符由3个部分组成：符头、符干和符尾。符头：一个空心或实心的圆，代表所要演奏的音符。符干：连接着符头的垂直短线。符干朝上时写在符头的右边，符干朝下时写在左边。符干的朝向没有任何的意义，只是为了方便阅读。一般来说，第三线以及位于第三线以下的音符，符干朝上。符尾：连接在符干末端的旗状标记。不论符干的朝向怎样，符尾一律写在符干的右边。符头、符干和符尾共同组成一个音符，它不仅会告诉你音高，还会告诉你音符的时值，也就是一拍有多长。边听音乐边打拍子，慢慢地就能抓住节拍了。认识乐谱方法之2：节拍步骤1：通常五线谱上每隔一段固定的时间就会出现一条竖直线，这些竖直线又叫小节线。第一条小节线之前的部分是第一小节，第一根和第二根小节线之间是第二小节，以此类推。小节线
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 （4） P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。
IR图谱分析方法
IR图谱分析方法 （1）首先依据谱图推出化合物碳架类型：根据分子式计算不饱和度，公式： 不饱和度＝F+1+(T-O)/2 其中： F：化合价为4价的原子个数（主要是C原子）， T：化合价为3价的原子个数（主要是N原子）， O：化合价为1价的原子个数（主要是H原子）， 例如：比如苯：C6H6，不饱和度＝6+1+（0-6）/2＝4，3个双键加一个环，正好为4个不饱和度； （2）分析3300~2800cm^-1区域C-H伸缩振动吸收；以3000 cm^-1为界:高于3000cm^-1为不饱和碳C-H伸缩振动吸收，有可能为烯, 炔, 芳香化合物,而低于3000cm^-1一般为饱和C-H伸缩振动吸收； （3）若在稍高于3000cm^-1有吸收,则应在 2250~1450cm^-1频区，分析不饱和碳碳键的伸缩振动吸收特征峰，其中： 炔 2200~2100 cm^-1 烯 1680~1640 cm^-1 芳环 1600,1580,1500,1450 cm^-1 若已确定为烯或芳香化合物，则应进一步解析指纹区，即1000~650cm^-1的频区 ,以确定取代基个数和位置（顺反，邻、间、对）； （4）碳骨架类型确定后,再依据其他官能团,如 C=O, O-H, C-N 等特征吸收来判定化合物的官能团； （5）解析时应注意把描述各官能团的相关峰联系起来，以准确判定官能团的存在,如2820，2720和1750~1700cm^-1的三个峰，说明醛基的存在。 至此，分析基本搞定，剩下的就是背一些常见常用的健值了！ …………………………………………………………………………………………………… ………
如何选择质粒
一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 P/E 启动子/增强子 Terms 终止信号 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AA TAAA 的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AA TAAA的保守序列，此位点down－stream 有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上. 三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写） 1. 什么是载体
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签 2）信标标签
3）纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4）酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
谱分析-相关函数法
海浪谱分析—相关函数法 一、 基本概念 已经提出的海浪频谱很多，其中大部分是由观测到的波要素连同某些假定推导出来的，大部分则利用定点波面记录通过特殊的谱分析方法得到。后一方法是目前得到海浪谱的主要手段。 在固定点连续记录到波面()t η，通常认为它是弱平稳的过程，其相关函数为： ()()()[]τηητ+=t t E R （1.1） 由已有理论可知此过程的单侧谱为 ()()dt e R S t i ωτπω-∞ ? = 2 （1.2） 假定海浪为具有各态历经性的平稳随机过程，可利用过程中的现实（一次波面记录）的离散值n x x x ,...,,21计算相关函数 ()()()t R t R m x x N t R N n n n ?-=?=-=?∑-=+ννννννν??,...,2,1,0,1?1 （1.3） 式中，N 为样本容量；ν-N 为乘积n n x x ν+的个数。由此相关函数并参照式（1.2）可得谱的估计值为 ()()t t e t R S t i m ?
代入式（1.5），t N T ?=，可得 ()21 2 1 221?∑∑=?=??=??=N n t n i n N n t n i n e x N t t e x t N S ω ωππω（1.7） 当1=?t 时，上式变为 ()πωπωω <=∑=，21 1 21?N n n i n e x N S （1.8） 而 ()()t S t S ??=ωω1 ??（1.9） 式（1.8）右侧称为周期图，它可通过对样本实行离散傅里叶变化得到。 因此估计谱通常有两种途径，其一通过相关函数，其二通过周期图。在每一途径中又可采用不同的方法。不管用何法，都要对实测记录取离散值，并进行中心化处理。采样间隔的选取，非常重要。在图（1.1）中，细线代表谱中圆频率为1ω的组成波，今按时间间隔t ?读取波面值，连接这些离散值得粗线所示的圆频率为()12ωω<的波动。容易推想，许多高频率的波动可表现为同一低频的波动。 设定义圆频率 t N ?=πω（1.10） 则可证明频率,...4,2N N ωωωω±±的波动，由于离散化的结果均变现为频率()N ωωω<的波动。 设k r ,都是整数，t k t ?=，则 ()t i r i ae ae N ωωωη==+2（1.11）
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
学习读谱
学习读谱 读谱是学习音乐必须掌握的基本技能之一。不管是演奏演唱、作曲或理论研究都应当掌握一种甚至数种读谱的方法。因此，它是普通中小学音乐教育的不可缺少的重要内容。就像读书必须学会认字一样。为了提高学生的音乐水平，这一基础必须打固加牢。 有一些学生把读谱看得很神秘，认为这是专业人士的本事。其实，学会简单的读谱并不难。只要按照正确的方法，循序渐进、勤学苦练、持之以恒，除了极个别生理上有缺陷的以外，一般人都是可以学会的。 学简谱，首先要懂得记谱法是怎样记录音的高低、长短和强弱的。但是，懂得记谱法的道理，并不等于会读谱。读谱是一种技能，必须进行一定的训练才能掌握。学会读谱的途径及方法多种多样，采用何种方法，则应根据对象和条件而决定。 读谱的主要内容，有两方面，即音的高低与节奏节拍。对初学读谱的人来说，既要注意音高，又要注意节奏节拍，往往顾此失彼，不易掌握。因此，初学读谱，最好把音高和节奏节拍分开来练。当掌握到一定程度之后，再把两者合起来练习，这样就比较容易了。 练习音高，要注意音高的准确性。因为它在读谱中有着特殊重要的意义。练习音准的方法和途径也有很多，练习时无须限定某一种方法，可根据具体的情况因地制宜。一般情况下，都是在老师的指导下，用键盘乐器来练习。假如没有指导老师的情况下，也可以自己跟琴练唱。跟琴练唱的，琴的音一定要准。一般情况下，风琴和电子琴都比钢琴的音要准一些，因为钢琴的琴弦会日久松弛而走音。 假若既没有知道老师又没有乐器，则使用最简单的方法——利用熟悉的歌曲，不唱歌词，专唱歌谱，来掌握do、re、mi、fa、sol、la、si，各音之间的音高关系。再将这些音按照各种不同的方式组合起来，还可以掌握更多的音程及音调。用这种方法来练习音准，虽然比较简单有效。但，在音的准确程度方面，往往较为差一点。 连习音准可以通过很多途径。如：唱音阶、单音、音程、和弦等等。在练习单音时可以先从中音区开始，再向上下扩展。因为，中音区较高低音区容易模唱。音程练习法则按照自然音程中的大二、大三、小三、小二……这样由易到难的次序来练习。音阶练习法也是先熟唱无升降号调式音阶，再向多个升降号调式发展。和弦练习法C大调调内大小三和弦及其转位。大小三和弦掌握后，再去练习小七及其转位。最后才练习减小七和弦及其转位。通过练唱和弦，同时也进一步复习了各种音程。 跟琴练唱时最好不要边弹边唱，而要先弹琴，在心中把音的高低记住，再模唱出来。但是，假若个别音阶音准不准确的话，也可以边弹边唱一段时间。唱时要用耳朵监听，听听自己唱的与琴声是否完全一样。