实验一融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取与分析

离心管的使用
手持离心管时注意不要触碰离心管内表面， 包括盖子内表面
实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀。
混匀、保温等反应后样品应瞬时离心将内容 物收集至管底后再进行下步的实验。
实验过程中应做好每个样品的标记工作，且 一般在离心管上用记号笔作标记时，应在两 处重复做好标记。
基因克隆（DNA重组）
工具酶
课程内容安排
一、融合蛋白 表达载体构建的设计与质粒提取及分析
实验课有关要求及注意事项 分子生物学实验有关基础知识及操作（微量操作，移液器及
酶的使用，称量，制板，灭菌等） 基因克隆的原理 蛋白表达载体的构建 细菌培养（液体和固体） 质粒DNA的提取及定量分析
二、重组质粒的构建
DNA酶切，电泳，纯化（讲解PCR产物纯化） DNA的体外连接
移液操作tips
吸酶或母液时，永远用新的干净的枪头。如果不幸污染了酶，请报告 老师。即使是稀释一梯度溶液，如要求很严格的体积，也必须使用新 的头。
检测是否漏气的方法：将吸取液体后的移液器垂直静置 15 秒，观察 是否有液滴缓慢 的流出。若有流出，说明有漏气现象。
严禁吸液后将移液器平放！ 对于粘稠液体可首先吸放几次，然后极缓慢地松开按钮，使溶液慢慢
第一部分：分子实验相关知识
Part I： 实验课有关要求及注意事项 Part II： 分子生物学实验有关基础操作 Part III：基因克隆的原理 Part IV： 蛋白表达载体的构建
第二部分：质粒DFra Baidu bibliotekA的提取及定量分析
Part I： 质粒DNA提取的原理 Part II： 方法步骤 Part III： 结果与分析
三、细胞转化
感受态细胞的制备及转化（CaCl2法，提前过夜摇菌）
四、重组质粒的鉴定（PCR法）
提前转板过夜 PCR原理，反应条件及PCR引物设计（软件操作） 重组转化子的鉴定——PCR法（介绍Cracking gel等方法） 重组转化者的保存（-70℃）
五、体外重组蛋白表达及分析
提前IPTG诱导 SDS-PAGE胶 Brand ford 蛋白定量分析 蛋白纯化及活性测定
当你使用紫外分析仪时，应戴上防紫外线的眼镜。如果用 它来切胶，请戴上面罩。
同位素实验必须在同位素室进行。不得随意将同位素室里 的任何仪器搬出来。完成同位素实验后，必须用仪器测定 所用物品，桌面及手套等， 肯定没有污染后方可离开同位 素室。
如果洒了化学，生物等危险物质，把那区域作一记号，并 马上汇报老师，作相应的处理。一般的药品溅出，应马上 用吸水纸清洁干净。
分子生物学实验室一般安全知识
不能在实验室吸烟，或吃喝东西。 当使用危险或潜在危险物质时，请穿上工作服，戴上手套，
保护眼镜和口罩。 请记住，使用EB，酚等危险物质时，必须戴手套， 并且应
该经常水洗手套的外围，以免污染仪器等。当你离开实验 室时，务必脱掉手套方可离去。使用同位素及酚时，建议 戴两层手套。 废物的处理：废液，强酸及强碱（须稀释）等液体可以倒 入水槽，并放水冲走。废纸等固体废物应倒入垃圾桶。废 弃的微生物以及培养它们的朔料枪头及管必须倒在指定桶 内以备消毒，培养基以及盛其容器必须高压消毒后方可作 普通物品处理。同位素实验的废液及物品，则分别倒在同 位素室里指定的容器里。EB胶倒在指定桶内。酚及氯仿及 盛它们的管分别倒在化学通风厨内的容器内。破碎的玻璃 制品必须倒在特定的桶内。
进入吸头内；否则，可使吸入体积减少。
移液器的校正
在25℃时，水的密度大约为1g/ml （mg/ul）. 如要校正2-20ul 移液器，取10和20ul水于分析天平上分别
称三次。 如要校正20-200ul 移液器，测量100和200ul的水。 如要校正100-1000ul 移液器，测量500和1000ul的水。 如果你的移液器误差超过了5%，请通知老师。
六、总RNA的提取及测定
组织总RNA的提取，变性胶鉴定 讲解RT-PCR
七、基因组DNA的提取及鉴定
基因组DNA的提取及鉴定 基因组和cDNA PCR，基因结构分析
八、基因的蛋白水平表达检测（Western blot）
Western blot 基因组DNA酶切胶检测 总复习，总结
实验一、融合蛋白表达载体构建的设计 与质粒提取分析
安装吸头
使用量程配套的吸头 将枪嘴垂直插入吸头盒的吸头上 轻轻用力向下压，同时把手中的移液器按顺时针
方向旋转180°，使吸头紧紧地扣在枪嘴上。
移液操作
一手拿住枪，另一手旋转转来设置你所要的容量。 把合适的枪头插入枪的末端，并轻微旋转一下。 把活动杆压下一档。这让枪定下你所要的容量。 把枪头直伸入液体约2-5mm深处。如果深入过深，
如化学物品溅到皮肤等，应马上用水冲洗。如轻微割伤并 没感染的话，可用红十字药盒里的止血贴，否则，马上送 医院。任何事故应马上报告老师。
量程：
0.5～10μl (读数窗显示0.5～10.0,精度为0.1μl) 5～50μl (读数窗显示5.0～50.0, 精度为0.5μl) 20～200μl (读数窗显示20～200, 精度为1μl) 100～1000μl (读数窗显示100～1000, 精度为5μl)
克 隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化：获取同一拷贝的过程。 DNA克隆（分子克隆、基因克隆、重组DNA ）：
应用酶学方法，在体外将外源性遗传性物质（DNA）与 载体结合成重组DNA分子，继而通过转化或转染宿主细 胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提 取获得大量同一DNA分子的过程。
将使枪头的外围粘上液体而导致取液的误差。 让活动杆慢慢地回到原始位置。否者，过快产生的
气雾将污染枪管和你的溶液。 让枪头在液中停一会，以便使液体完全进入枪头。
如果枪头从液中移开太快，可能会有空气在枪头中。 应目测是否有气泡或者所取的量是否符合你的要求。 把枪头贴在液面附近的管壁或管底，然后把液体 放出。须检查是否还有液体在枪头中，如是，慢慢 把液体放入管中。 把枪头去掉，扭回最大量程处。