表达载体转化的方法
克隆载体与表达载体
染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体
其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。
人工染色体载体拷贝数少，制备困难，通常采取“穿梭载体”的策略来解决
含有质粒载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点，这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制，含有第二受体(如酵母)端粒(TEL)、DNA复制起始位点(ARS)和着丝粒(CEN)以及合适的选择标记。载体在体外与目的DNA重组后转化到第二受体细胞，按照染色体复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子一般采用抗生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子常用与受体互补的营养缺陷型。
克隆载体
基本性质
基本特征（或载体的构建）
原理机制
常用的载体
克隆载体
质粒载体
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒）
（1）具有合适的复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
M13噬菌体产生单双链DNA的机制）
LacZ’ 5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点
一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（抗菌素选择原理）
原核表达系统的工作原理
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。
转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。
（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。
瞬时表达载体构建方法
瞬时表达载体构建方法
构建瞬时表达载体的方法主要包括以下几个步骤：
1. 选择合适的表达载体，一般选择能够在目标细胞中高效表达
的载体，如常用的包括pCDNA3.1、pcDNA3.1、pEGFP等。
2. 插入目标基因，将要表达的外源基因插入到表达载体的多克
隆位点或者启动子和标签的下游，通常使用限制性内切酶切割和连
接的方法将目标基因插入载体中。
3. 转染目标细胞，将构建好的瞬时表达载体转染到目标细胞中，常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体介导转染等。
4. 诱导表达，根据需要，可以通过加入适当的诱导剂（如化学
诱导剂、温度等）来诱导载体中的外源基因表达。
5. 蛋白质表达分析，通过蛋白质免疫印迹、荧光染色、荧光显
微镜观察等方法来分析外源基因在目标细胞中的表达情况。
总的来说，构建瞬时表达载体的方法是一个多步骤的过程，需
要仔细设计实验方案，并根据具体的实验要求选择合适的表达载体和转染方法，以确保外源基因在目标细胞中的瞬时高效表达。
这些方法在分子生物学和细胞生物学研究中具有重要的应用价值。
菌种构建的过程
菌种构建是一个涉及遗传工程和分子生物学技术的过程，旨在通过直接改变微生物的遗传物质来赋予或增强特定的生物学特性。
这一过程广泛应用于发酵工业、生物制药、环境治理、农业等领域。
以下是菌种构建的一般步骤：1. 目标基因的克隆与合成：- 首先需要确定所需赋予微生物的特性，比如抗性、特定代谢能力等，然后找到或合成相应的基因。
- 可以通过基因克隆技术从基因库中获取，或通过化学合成方法合成目标基因。
2. 基因表达载体的构建：- 将目标基因插入到表达载体中，这个载体通常是一个质粒或人工染色体，它能在宿主细胞中复制和表达目标基因。
- 表达载体设计时需考虑启动子、终止子、调控元件等因素，以确保基因的高效表达。
3. 转化：- 将构建好的表达载体转化到目标微生物中。
转化方法包括钙离子处理、电转化、脂质体介导转化等。
- 转化效率通过蓝白筛选等方法进行初步鉴定。
4. 转化子的筛选与验证：- 通过抗生素抗性或其他选择性标记来筛选成功转化的菌株。
- 通过PCR、DNA测序等分子生物学方法验证目标基因是否成功插入和表达。
5. 遗传稳定性分析：- 评估转化子在宿主细胞中的遗传稳定性，确保基因能够稳定传递给后代。
6. 生物特性评估：- 通过发酵试验、生物活性测试等方法，评估转化子是否获得了预期的生物学特性。
7. 优化与改良：- 根据评估结果对菌种进行进一步的优化和改良，可能涉及菌株的生理、代谢和生长条件的调整。
8. 大规模培养与应用：- 最终确定后，将菌种用于大规模生产或应用。
在整个菌种构建过程中，需要遵守相关的生物安全法规和指导原则，确保操作的安全性和环境的可持续性。
同时，科研人员和工程师还需要不断学习最新的科研进展和技术创新，以提高菌种构建的效率和成功率。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤【1】一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
表达载体的构建方法及步骤
令狐采学创作表达载体的构建方法及步骤令狐采学一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：(1)复制起始位点(加即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
(2)抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,I<an+(3)多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段(4)P/E启动子/增强子(5)Terms终止信号(6)加poly (A)信号可以起到稳定mRNA作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：[1]构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：令狐采学创作令狐采学创作(1)克隆载体的克隆能力一据克隆片段大小(大选大，小选小)。
如＜n)kb选质粒。
(2)表达载体据受体细胞类型一原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
(3)对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位; 表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产主阅读框架错位。
综上所述，选用质粒(最常用)做载体的5点要求：(1)选分子量小的质粒，即小载体(l-1.5kb) 一不易损坏，在细菌里面拷贝数也多(也有大载体)；(2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般1()个以上的拷贝，而严谨型质粒＜1()个。
(3)必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；(4)必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr (试一试)。
(5)满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性(如Pur。
植物抗体制备
植物抗体制备
植物抗体制备是一种生物技术方法，用于从植物中收集和纯化特定目标蛋白的抗体。
下面是一种常见的植物抗体制备方法：
1. 选择表达载体：选择适合在植物中表达目标蛋白的表达载体，并将目标蛋白的编码序列插入该载体中。
2. 转化植物细胞：将表达载体导入植物细胞中，可以通过基因枪法、农杆菌介导法等方法进行。
3. 筛选转化植株：通过对转化植株进行筛选，例如利用抗生素选择性培养基，筛选出携带目标蛋白表达载体的转化植株。
4. 扩大培养：将筛选得到的转化植株进行扩大培养，使其生长成成熟植株。
5. 收获植物材料：收获植物材料，包括根、茎、叶等组织，用于提取目标蛋白。
6. 蛋白提取：利用蛋白提取缓冲液等方法，将目标蛋白从植物材料中提取出来。
7. 抗体纯化：利用亲和层析、凝胶过滤、电泳等方法，对提取的目标蛋白进行纯化，得到纯化的目标蛋白。
8. 免疫原制备：将纯化的目标蛋白用于免疫动物（如小鼠）以制备抗体。
9. 抗体收集：从免疫动物中收集得到的抗体，可以通过抗体纯化和浓缩等步骤进行进一步纯化和处理。
10. 抗体检测：利用收集到的抗体，可以进行免疫组化、免疫印迹、ELISA等方法对目标蛋白进行定量和定位分析。
表达载体导入微生物的方法
表达载体导入微生物的方法
表达载体是将外源基因导入到微生物中进行表达的工具。
常见的表
达载体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
下面介绍几种常用的表达载
体导入微生物的方法。
1. 转化法转化法是最为简单直接的一种方法，
适用于大多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
该方法利用电击或热激
等手段使DNA进入细胞内部，然后通过自身复制来实现目标基因在宿
主细胞内部的表达。
2. 病毒感染法病毒感染法通常采用噬菌体作为载体，通过寄生于宿主细胞并注入其遗传信息来实现目标基因在宿主中
的表达。
这种方法可以快速高效地将外源基因导入到宿主中，并且能
够实现定向插入和高水平表达。
3. 电穿孔法电穿孔法是一种新型而有
效率较高的DNA转移技术，可应用于各类真核及原核细胞之间以及不
同组织器官之间进行DNA转移操作。
该技术利用脉冲电场对目标组织
进行刺激，在此过程中形成暂时性小孔从而使得外源 DNA 进行了有效
地输送与传递。
4. 化学处理法化学处理法也称为钙离子共沉淀（CaCl2）或者PEG共沉淀（聚乙二醇），即先将质粒与盐溶液或聚合物相结合
形成颗粒，再加上特殊条件如温度、时间等促进颗粒与受体微生物发
生黏附反应，并最后让其自然恢复正常状态完成整个过程。
总之，在
选择哪种方式去导入我们所需要使用到微生物里面时候还需根据具体
情况去考虑选取何种方式才更加符合我们所要求得结果！。
构建表达载体的实验流程及其注意事项
质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力
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质粒的电泳
Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
30
质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
12
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
2
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上
利用酵母菌表面展示技术筛选功能蛋白的操作步骤
利用酵母菌表面展示技术筛选功能蛋白的操作步骤酵母菌表面展示技术是一种重要的筛选功能蛋白的方法，它能够将目标蛋白展示在酵母菌表面，使其易于筛选和分析。
下面将介绍利用酵母菌表面展示技术筛选功能蛋白的操作步骤。
1. 目标蛋白的选择：首先，需要选择需要筛选的目标蛋白。
这个目标蛋白可以是任何具有特定功能或特性的蛋白质，例如抗原、酶、受体等。
确保目标蛋白的基因序列已经获得，并已克隆到适当的表达载体中。
2. 构建表达载体：将目标蛋白的基因序列插入到酵母菌表面展示系统所用的表达载体中。
这个表达载体通常包含一个酶标记，用于便于后续检测目标蛋白的表达和定位。
确保基因序列的正确插入和方向后，将表达载体转化到酵母菌细胞中。
3. 转化酵母菌：将构建好的表达载体转化到酵母菌细胞中。
这可以通过化学方法、电穿孔法或电转法来实现。
转化后，将转化后的酵母菌细胞培养在适当的培养基上，以促进其生长和表达目标蛋白。
4. 诱导表达：一旦酵母菌细胞达到适当的生长密度，可以通过添加诱导剂来诱导目标蛋白的表达。
这个诱导剂可以是适当的药物物质，如甘露醇，或通过调节培养基的条件来实现。
5. 表面展示：在目标蛋白的表达过程中，目标蛋白将被送到酵母菌细胞的表面展示。
这通常是通过将目标蛋白与酵母菌细胞表面蛋白的锚定域结合来实现的。
锚定域通常是一个具有高亲和力的结合结构，可以将目标蛋白稳定地锚定在酵母菌表面。
6. 筛选和分析：一旦目标蛋白成功展示在酵母菌表面，可以使用适当的检测方法进行筛选和分析。
常用的方法是通过与目标蛋白相互作用的配体进行特异性的结合和筛选。
这可以通过酵母菌生长抑制试验、酵母菌双杂交等方法实现。
7. 获得纯化的功能蛋白：筛选出具有特定功能的目标蛋白后，可以通过适当的纯化技术来获得纯化的功能蛋白。
这可以通过亲和层析、凝胶电泳、膜过滤等方式来实现。
8. 验证功能蛋白的活性：最后，需要对获得的功能蛋白进行活性验证。
这可以通过适当的酶活性测定、配体结合实验等方法来实现，以确保蛋白的功能和特性。
克隆载体与表达载体
克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。
② IG区内只有一个Bsu I 切点。
（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。
M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。
使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。
而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。
能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。
cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。
黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。
克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。
有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。
质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。
基因工程-基因表达载体构建(2)
（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 DNA分子杂交 方法，用 DNA与RNA杂交 方法检测目的基因是否转录，用 免疫（ 抗原抗体反应 ）法检测目的基因是否表达。另外也 让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。 可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因 DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱 ；
（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞 受精卵 等。动物常把 细胞作为受体细胞。导入植物细胞的 方法有 等；农杆菌转化 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 染色体DNA 法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的 显微注射法 上，导入动物细胞的方法有 ；如果运载体是质 CaCl2 处理，以增大细菌 细胞壁 粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用 的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的 基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制， 由于 细菌繁殖的速度非常 ，在很短的时间内就能够获 快 得大量的目的基因。
途径 方法
供体细胞中的DNA 中直接分离基因 鸟枪法
供体细胞中的DNA ↓限制酶 许多DNA片段 ↓载入 运载体 ↓导入 受体细胞 ↓ 外源DNA扩增, 产生特定性状 ↓分离 目的基因
人工合成基因（真核细胞） 反转录法
目的基因mRNA ↓反转录 单链DNA ↓合成 双链DNA(即目的基因)
根据已知氨基酸 序列合成DNA
氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则
转基因表达成功的原因是生物 共用一套遗传密码 。 基因工程的意义： 。 目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。
实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺 中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可 想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？
将基因表达载体导入受体细胞的方法
将基因表达载体导入受体细胞的方法基因表达载体是研究基因功能和蛋白质表达的重要工具。
将基因表达载体导入受体细胞是通过转染等方法将外源DNA转入目标细胞的过程。
本文将介绍几种常用的方法，包括传统的转染方法、化学转染方法和生物物理方法。
1.传统的转染方法2.化学转染方法化学转染方法是通过化学物质的辅助作用，将DNA导入细胞内。
目前常用的化学转染试剂包括阳离子聚合物（例如聚乙烯亚胺、聚赖氨酸等）和脂质体（如转精胺酸脂质体、聚精氨酸脂质体等）。
这些试剂能够与DNA形成复合物，然后与细胞膜结合并转运入细胞质。
这种方法的优点是操作简单、转染效率高、适用于多种细胞类型。
但是，转染过程中可能伴随着细胞毒性和炎症反应，且大部分试剂对细胞具有一定的毒性。
3.生物物理方法生物物理方法是通过物理性质的变化促进DNA进入细胞。
常用的生物物理方法包括电穿孔法和微粒加速法。
电穿孔法是通过高电压电击细胞，使细胞膜发生临时孔洞，从而使DNA能够进入细胞质。
微粒加速法是将DNA包裹在纳米粒子中，然后通过射击的方式将纳米粒子带入细胞内。
这些方法的优点是适用于多种细胞类型，转染效率高。
但是，生物物理方法对细胞的损伤较大，且技术要求较高。
除了以上介绍的几种常用方法外，还有其他创新的转染方法，如病毒载体转染、纳米转染等。
病毒载体转染是将目标基因插入病毒基因组中，然后利用病毒的感染能力将目标基因导入细胞内。
纳米转染是利用纳米颗粒的载体功能，将DNA包裹在纳米粒子中，然后通过纳米粒子的尺寸和表面特性，实现DNA导入细胞内。
这些方法在一些研究领域具有独特的优势，但也存在一些限制和挑战。
综上所述，将基因表达载体导入受体细胞是基因功能和蛋白质表达研究的关键步骤。
选择合适的转染方法可以提高转染效率，并进一步推动基因工程和生物医学研究的发展。
不同的细胞类型和研究目的可能需要不同的转染方法，研究人员应根据实验需求选择最适合的方法，并不断探索和优化转染技术。
外源蛋白在大肠杆菌中的表达
外源蛋白在大肠杆菌中的表达一、引言外源蛋白是指不属于宿主生物体自身的蛋白质，通常是由其他生物体合成的蛋白质。
在大肠杆菌中表达外源蛋白已经成为了基因工程和生物技术领域中的一个重要研究方向。
本文将从大肠杆菌表达外源蛋白的原理、方法、策略等方面进行详细阐述。
二、原理1. 大肠杆菌表达系统原理大肠杆菌表达系统是指利用大肠杆菌作为宿主细胞，通过转化外源DNA进入细胞，使其在细胞内得到表达并产生相应的蛋白质。
这个系统包括三个部分：载体、宿主细胞和诱导剂。
2. 质粒载体质粒载体是指一种环状DNA分子，可以携带外源DNA序列并在大肠杆菌中进行复制和表达。
常用的载体有pUC19、pET28a等。
3. 宿主细胞宿主细胞是指被转化了质粒载体的大肠杆菌细胞。
常用的宿主细胞有BL21(DE3)等。
4. 诱导剂诱导剂是指在宿主细胞中引发表达外源蛋白的物质。
常用的诱导剂有IPTG、L-arabinose等。
三、方法1. 克隆外源DNA序列到质粒载体中将外源DNA序列克隆到质粒载体中，形成表达载体。
常用的方法有限制性酶切和连接法、PCR扩增法等。
2. 将表达载体转化到宿主细胞中将表达载体通过热激转化或电转化等方法导入到宿主细胞中，使其在细胞内进行复制和表达。
3. 选择正常表达的克隆通过筛选，选择出正常表达目标蛋白的克隆。
常用的筛选方法有PCR 检测、Western blotting等。
4. 诱导表达目标蛋白在选定的克隆中加入适量的诱导剂，使其开始表达目标蛋白。
通常在温度、时间、浓度等方面进行调节，以得到最佳效果。
四、策略1. 选择合适的载体和宿主细胞根据需要表达的外源蛋白的不同，选择适合的载体和宿主细胞。
例如，如果需要表达带有His标签的蛋白质，可以选择pET28a载体和BL21(DE3)宿主细胞。
2. 优化表达条件通过调节温度、时间、浓度等参数来优化表达条件，以提高目标蛋白的表达量和纯度。
3. 联合表达将多个外源蛋白基因克隆到同一个载体中，使其在同一宿主细胞中进行联合表达。
克隆载体与表达载体
噬菌 粒载 体
M13-DNA 那样体外包 装，并高效转染受体细 胞 装载量比常规的 M13mp 系列要大很多
点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌 体 DNA 间隔区(含有噬菌体 DNA 复制 起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所 必需的全部顺式作用元件)
个 ampr 基因作为选择记号，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高 4. 存在着一个多克隆位点区，因 此多种不同类型的外源 DNA 片段，不经修饰便可 直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大
噬 黏粒 装，并高效转染受体细 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。 DNA 可大于 40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ
菌 载体 胞；能像质粒那样在受 克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。 一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。
体-
体细胞中自主复制具有 有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在
质
M13 噬菌 体的 基 因组 为单链 DNA。噬菌体颗 粒的大小受其 DNA 端 点制约的，不存在包装 限制。只感染雄性大肠 杆菌
(1)基因组大小；去除非必需区，建立外 源 DNA 片段的克隆或替换位点（2）在 DNA 的非必需区插入选择标记：lacZ 基因；基因 cⅠ 失活（cI 基因：溶源 过程控制基因）；Spi 筛选（野生型 λ 噬 菌 体 在 带 有 P2 原 噬 菌 体 的 溶 源 性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型， 称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏 感） 基因间隔区（intergenic region, IG 区） 基因 II 与基因 IV 之间存在一段 507bp 的基因间隔区，内含有复制起始 位点，是实施改造、构建人工载体的重 点区域。② IG 区内只有一个 Bsu I 切 点。（2）加入酶切位点，在 IG 区内加 入单一内切酶位点。M13mp1 在 IG 区
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得实习生：李宇皓，实习时间为2017年11月27日-12月25日。
这次实习是去农学院，具体是一个专业—园艺科学。
这是我第三次参加此类型的实习了。
前两次都是上课的形式，今天终于亲自动手操作了！还不错吧!这也算是我实践性比较强的一门课了。
实习内容包括有：《植物基因组文库构建》、《植物多样性》、《植物基因组工程与应用》、《植物抗病虫害》。
最后进行分组讨论会，向指导老师汇报成果，感觉很棒啊！从10月30号到12月13号，五天时间里，我们几个同学根据实际情况，做好各项准备，完成了毕业设计的前期任务，并在第六周开始正式着手整个课题的研究工作，可谓万事俱备只欠东风了！
实验目的和要求：1.掌握植物基因组文库构建方法2.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的方法3.掌握基因组文库构建与高密度筛选4.熟悉多克隆抗体技术5.理解基因工程原理6.通过外源基因表达产物对花卉新品种的选育作用以及利用反义技术实现基因定位和标记
等相关问题。
实习步骤（含内容）：实习一：了解植物基因组文库构建概念及意义；制定实验方案；进行文库构建；并利用文库分析植物进化史。
实习二：分离转录间隔区序列；目的基因与其他基因的分离纯化；目的基因的克隆及转化载体构建；目的基因的 PCR 扩增、测序与分析；目的基因片段的克隆；基因片段的连接；基因文库构建及质量检查。
- 1 -。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
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目前外源基因导入叶绿体基因组的方法主要有基因枪转化法、PEG介导转化法、显微注射及激光注射法、转运肤介导的叶绿体间接转化法、电击法等。
(1)基因枪转化法
基因枪法是20世纪80年代后期发明的，它是将外源DNA(通常是带有目
的基因的质粒载体)如附在金属颗粒(如钨、金等)表面，然后通过高压动力装
置将金属颗粒轰击到受体细胞中的特定部位。
基因枪法是目前己被验证的叶绿体基因组转化转化效率最高、采用最多的方法。
大多数己经成功的叶绿体基
因组转化都是用这种方法实现的。
它可以通过人为控制，将外源DNA导入到
细胞核及细胞器(如叶绿体体、线粒体等部位)中。
基因枪法不受物种和基因型
的限制，转化后的组织可以迅速再生成植株，并且这一方法适合于不同种类的植物，其缺点是成本较高，操作复杂，不易普及到所有实验室。
(2)PEG介导转化法
PEG介导转化法是在PEG存在的情况下将去壁的受体细胞原生质体暴露
在纯化过的外源DNA中，由于PEG的存在，原生质体会先缩水，然后细胞膜结构会发生重构，在细胞膜结构到达不可逆破坏之前除去PEG，细胞膜结构又会回复到原先的自然稳定状态。
在此过程中，外源DNA有机会进入胞内及质
体内，从而实现外源基因的转化。
Golds等用PEG介导转化法成功地实现了烟草的原生质体转化，为质体转化提供了一条新的途径。
该方法虽然成本较低，但原生质体的制备和再生比较困难，使得转化植株的再生频率较低，从而限制了这一方法的普遍应用。
到目前为止，只有PEG法在烟草质体转化中获得成功的报道。
(3)显微注射及激光注射法
显微注射及激光注射法就是利用能量很高、直径很小的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔，从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法。
早在1987年，webe等就利用微束激光照射油菜细胞，将用荧光素标记的外源DNA 导入叶绿体，观察到荧光显示，并且发现这一处理对叶绿体的光合能力和细胞的分裂能力影响较小。
由于激光微束穿刺技术操作简便，转化频率高，从而引起了许多科学家的重视，由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展。
此后，Kllobfauch等研究开发出了一种称为“毫微注射技术”(几mtojeetionteehnique)的叶绿体基因组转化方法。
该方法是用一种亚显微直径为
0.1rnrn的微型注射器(femtosyringe)将10一15几(fL,femtoliter)的外源DNA直接导入完整植物细胞的叶绿体中。
此种注射器是根据锢(indium,In)、稼(gallium,Ga)、和锡(tin,sn)组成的液态合金“gahnstan”的热膨胀原理制造的。
由于这种合金具有很好的热传导性，热诱导的galinstan膨胀可以很好地控制注射速率，注射器不会对叶绿体细胞器造成明显的损伤。
激光微束穿刺法对细胞的损伤小而且操作简便，可以准确定位于被照射的细胞,实验重复性好，己成为一种行之有效的转基因手段。
但与农杆菌介导法相比，激光微束穿刺法转化效率较低，且激光微束仪设备复杂造价昂贵，因此限制了此技术的推广普及。
(4)转运肤介导的叶绿体间接转化法
此方法的原理是在构建植物定点整合表达载体时，将外源基因和叶绿体的转运肤编码序列相连，然后用细胞核转化技术把外源基因导入植物细胞。
这样外源基因编码的蛋白质就有可能在转运肤的引导下输送到叶绿体细胞器中去，从而克服叶绿体DNA多拷贝的问题，并且在很大程度上还可缓解转化体的分离。
例如Bogoradl将PsbA同转运肤序列融合后，通过Ti质粒导入烟草的核基因组后，在细胞质中合成的融合蛋白基因产物在转运肤的作用下输入到叶绿体腔内，间接地实现了叶绿体的转化。
采用转运肤介导目的基因的方法虽然没有将外源基因整合到叶绿体基因组中，但可以使外源基因的产物蛋白定位到叶绿体中。
由于细胞核转基因技术己经相当成熟，因此，这种间接的采用转运肤介导叶绿体转化的方法可能是一条值得采用的途径。
(5)电击法
电击法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上进行“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄入，此法最早是在动物细胞中得到应用，并取得了很好的效果。
现在这一方法已被广泛应用于各种植物，例如Guerche用纤维素酶处理油菜2周龄的嫩叶后获得原生质体，将原生质体置于电穿孔仪中进行电击转化处理，筛选得到了21个抗性克隆，并最终获得了2株转化植株，其形态和育性完全正常；黄家总等用电击细胞融合的方法成功地使桂竹香和紫罗兰的原生质体产生融合。
由于该方法对细胞没有毒害作用，融和同步性好，并且操作简便，整个过程中的参数容易控制，可在显微镜下观察融合的全过程，因此已被广泛应用于动植物及微生物细胞的融合。
电穿孔技术转化三角褐指藻
以三角褐指藻为受体细胞，利用电穿孔法将构建好的三角褐指藻叶绿体基因组定点整合表达载体pRC一GFP转化进三角褐指藻叶绿体中，用不同浓度的氯霉素进行阳性藻株的筛选，扩大培养后在激光扫描共聚焦显微镜下检验绿色荧光蛋白GFP的表达情况，并提取阳性藻株的总DNA进行CAT基因表达盒的扩增，进行分子水平的验证。
3.1实验材料
藻种及质粒
三角褐指藻由暨南大学藻种库保存。
质粒pPtc一GFP为上一章中所构建。
主要培养基和试剂的配制
1)f/2(Si一)培养基配制同2.1.4
2)1%f/2固体培养基的配制:1L f/2液体培养基(不加生长素)加入10g琼脂粉，高压灭菌后温度降至40℃左右时加入生长素。
3)100mg.ml-1氯霉素的配制:称量1g氯霉素溶于10ml无水乙醇中，分装后用锡纸包住。
3.2实验方法
3.2.1电穿孔法转化三角褐指藻
待藻细胞进入对数生长期后，进行电击实验。
具体操作步骤如下：
1)离心收集l.0xl07一108个藻细胞，1394xg离心10min，弃上清。
2)加150ul 1.0molL-1NaCL悬浮藻细胞，再加150ul 0.1molL-1甘露醇，
混匀，冰上放置30min。
3)将藻液转移到0.4cm电激杯内，电激杯内藻液以不超过400 ul为宜，同
时加质粒pPtC-GFp(0.4 ug)混匀。
4)将电激杯放置好，调电穿孔仪电容至25F，电阻为400欧，电压为1.5kv，
进行电击。
5)将电击后的藻液转移到50ml三角瓶中，加新鲜的f/2培养基10ml，暗
处理2h，再正常培养24h(12L:12D)。
3.2.2氯霉素筛选阳性藻株并扩大培养
收集培养电击后培养了24h的藻液，155×g离心5min收集藻细胞，用新鲜的f/2(Si一)培养基悬浮藻细胞，将藻细胞分别涂布于含有氯霉素(200ug.ml-1、300ug.ml-1和400ug.ml-1)的f/2(si-)固体培养基平板上进行筛选。
挑取在抗性平板上长出的转化子藻落，转接于含有相应浓度抗生素的f/2(si一)液体培养基中扩大培养。
每7天更换一次含相同浓度氯霉素的培养基。
3.2.4氯霉素乙酞转移酶(CAT)基因表达盒在阳性藻株中的扩增
l)提取扩大培养后的阳性藻株总DNA。
具体步骤如2.2.2
2)以阳性藻株总DNA为模板，利用引物P5、P6扩增氯霉素乙酞转移酶(CAT)表达盒。
片段CAT基因表达盒的PCR反应体系为20ul，
取5ul扩增产物与1ul 6×LoadingBuffer混匀后以1%琼脂糖凝胶电泳检查结果，并拍照。
3.3结果与分析
阳性藻株经过氯霉素筛选后的生长状况
l)平板筛选后长出的藻落
将电击后的藻液离心重新悬浮后涂到均匀涂布在含有不同浓度(200ug.ml-1、300ug.ml-1和40ug.m-1 )氯霉素的f/2( Si- )固体培养基上，倒置于智能人工气候箱中培养，经过10至15天后，对照组在200ug.ml-1氯霉素平板上无可见藻落(图3一1A)，而实验组在200ug.ml-1、300ug.ml-1,和400ug.ml-1，氯霉素筛选浓度下可看到清晰的藻落长出(图3-1B,C,D)。
说明200ug.ml-1，,筛选浓度下己经完全可以抑制藻细胞的生长，而电击后的三角褐指藻对氯霉素产生了抗性。