植物基因转化

Ori区(复制起始区)：Ori 区上的基因调控Ti 质粒 的自我复制
Ti 质粒的4 个功能区域
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植物表达载体构建—Onc卸甲载体（受体Ti质粒） 的构建
野生型Ti质粒缺点 1.质量过大 2.酶切位点多 3.T-DNA区Onc基因 干扰宿主激素平衡 4.不能在大肠杆菌中 复制 5冗余基因 Onc卸甲载体：无毒的Ti 质粒载体。切除了T-DNA 中的Onc致癌基因。缺失 部分被大肠杆菌的常用质 粒pBR322区段（含Ampr) 取代。任何适合于克隆在 pBR322质粒中的外源 DNA片段都可以通过与 pBR322质粒DNA的同源 重组而被共整合到Onc-Ti 质粒载体上。
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植物表达载体构建—共整合载体系统
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植物表达载体构建—双元载体系统
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双元载体杆菌与共整合载体区别
双元载体杆菌与共整合载体所不同的 是，它不依赖两个质粒之间的同源序 列，不需要共整合过程就能在农杆菌 内独立复制，从大肠杆菌转移到农杆 菌的频率比共整合质粒的转移频率高 10000倍。且改造的Ti质粒时其多克 隆位点无导入pBR322质粒的同源片 段。
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三亲交配法
无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把中间载体质粒由 大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，通常把这 一过程称为三亲交配法。
1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协 助质粒的大肠杆菌） 3.供体菌（带有重 组植物表达载体的 大肠杆菌）
原理：三种菌混合 时，协助质粒游动 进入供体菌中，将 供体菌中的表达载 体转移到受体菌中， 最后经过适当的抗 生素筛选即可获得 土壤农杆菌转化结 合体
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Ti质粒结构
7Hale Waihona Puke Baidu
T-DNA区：T-DNA是根瘤农 杆菌侵染植物细胞时从Ti 质 粒上切割下来转移到植物细 胞的一段DNA，含有编码植 物激素和冠瘿碱的基因
Vir 区：Vir 区上的基因 能激活T-DNA 转移，使 根瘤农杆菌表现出毒性
Con 区(接合转移编码区)：该 区段上存在与细菌间接合转移 的有关基因，调控Ti 质粒在农 杆菌之间的转移
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叶盘转化法
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DNA直接转化植物-原生质体共培养转化法
以原生质体作为受体 细胞，通过将根癌农 杆菌与原生质体作短 暂的共培养，然后洗 涤除去残留的根癌农 杆菌后，置于含抗生 素的选择培养基上筛 选出转化细胞，进而 再生成植株。 优点：与叶盘转化法 相比，此法得到的转 化体不含嵌合体，一 次可以处理多个细胞， 得到相对较多的转化 体。应用此法进行基 因转化时，其先决条 件就是要建立起良好 的原生质培养和再生 植物技术体系。
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整株感染法
人为地在植株上造成创伤，然后把 含有重组质粒的根癌农杆菌接种在 创伤面上，或把含有重组质粒的根 癌农杆菌注射到植物体内，使菌体 在植物体内进行浸染实现转化。
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植物病毒载体
植物病毒可以用作基因转移和表达的载体， 这可以作为使用农杆菌或DNA直接转移来 进行稳定转化的一种替代方法。
DNA病毒载体 花椰菜花叶病毒 双粒病毒
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植物基因转化技术
农杆菌介导的转化 叶绿体转化 DNA直接转化植物 整株转化 植物病毒载体
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农杆菌介导的转化
冠瘿是一 种植物肿 瘤；冠缨 组织是真 正的瘤性 转变组 织．
黑莓藤上的冠瘿
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根瘤农杆菌诱导植物肿瘤
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Ti质粒
Ti质粒（tumorinducing plasmid）： Ti 质粒是根癌农杆菌 染色体外的遗传物质， 为双链共价闭合的环 状DNA分子,与肿瘤诱 导有关（>200kb）。 Ti质粒中有一段DNA， 称为T-DNA（transferDNA）（约23kb）， 能转移并整合到植物 基因组中，并导致冠 瘿瘤的形成。
RNA病毒载体 烟草花叶病毒 马铃薯病毒X
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改造后的Ti质粒的基本结构
右边界序列 DNA复制起始位点 选择标记基因 T-DNA的边界序列 多克隆位点
左边界序列
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Ti质粒介导转化的过程
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植物表达载体构建—中间载体的构建
带有重组T-DNA的大肠杆 菌质粒衍生载体称为“中 间载体”。
基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物基因组中去的一 段DNA，总长度约为23kb）片段克隆到普通载体pBR322 上，把外源基因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外 源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌转化植物把该 外源片段导入植物体内。