植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
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DNA区分割开来以后， Vir基因仍然能够为T-DNA提供转移功能
13
毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种
➢ 组成性表达：在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水
平； VirA属于组成型表达的位点
➢ 诱导性表达：即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受 伤组织时，植物细胞分泌的信号分子（乙酰丁香酮及羟基乙酰
10
Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
5
第一节 植物遗传转化载体的种类及特点
一、植物遗传转化载体的特点
作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能： 1.能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去 2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，以保 证导入的外源基因能在受体植物细胞中正常复制和表达
6
二、植物基因工程载体的种类
7
第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建
根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 名词：一元载体、双元载体、卸甲载体 叶绿体转化的优势与意义 遗传转化中常用的选择标记基因、报告基因
3
植物遗传转化的基础
植物遗传转化
也称为转基因技术 (transgene technology) 是指将人工分离和修饰过的外源基因导入生物体的基因组
中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术
15
二、发根农杆菌Ri质粒的结构和功能
Ri质粒：200kb-800kb，其基本结构也与Ti质粒相似，包括致瘤区 （Vir区）、T-DNA区和复制起点Ori。
根据其合成的冠瘿碱种类的不同可分为三类：农杆碱型、甘露碱 型和黄瓜碱型。
农杆碱型Ri质粒有两段T-DNA，即TL和TR，可以分别插入植物基因 组； 甘露碱型和黄瓜碱型Ri质粒只有单一T-DNA，甘露碱型和黄瓜碱型 Ri质粒的单一T区除其25bP边界重复序列外，其他部分与Ti质粒同 源性很低，但它们与农杆碱型Ri质粒的TL区有较高的同源性。
合物（T-DNA-VirD2） VirE蛋白––与单链T-DNA结合（ 形成T复合物），保护T-DNA不被
胞外核酸酶降解转入植物细胞，整合到寄主基因组中 VirC蛋白––与切割单链T-DNA有关 VirF蛋白––协助T-DNA转移到宿主植物细胞中 VirH蛋白对植物产生的杀菌或抑菌物进行解读
该区段上编码的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故也 称作致毒区。T-DNA区与Vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一
Vir区段总长度大约35kb，由6个互补群组成，分别命名为VirA、 VirB、VirC、VirD、VirE、和VirG。
Vir区中各个基因之间都是相互联系相互影响的，缺一不可。 当Vir基因与T-DNA分别位于两个不同的复制子上时，即Vir区与T-
4
植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不涉及非目标累赘 基因，因而更具有针对性，可加快育种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制，扩大可利用的资 源库（动物、植物、微生物、人工合成基因均可利用）；
可创造出自然界所没有的新种质； 以转基因植物为主体的植物化工厂具有高效、低污染、可再生的优点。
农杆菌是一类革兰氏阴性土壤杆菌（G－），活在植物根的表面依靠 由根组织渗透出来的营养物质（冠瘿碱）生存的一类细菌。
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
丁香酮）作用下才能启动表达；VirB、VirC、VirD和VirE是属
于诱导性表达的位点
➢ virG既为组成型表达，也具有诱导表达的特性，在信号分子的 诱导下，表达量提高10倍
14百度文库
Vir区基因的功能：
VirA蛋白––帮助植物细胞接受植物信号分子 VirG蛋白––对毒性区的其他基因进行正调节 VirB蛋白––形成膜通道，使T-DNA转移到细菌细胞外 VirD蛋白––VirD1、 VirD2诱导T-DNA形成单股DNA片段，并形成复
16
三、Ti质粒载体的改造
Ti质粒作为载体的可能性
能够自发地整合到植物的染色体上 能转化多种植物 强启动子：T-DNA的oPine合成酶基因上有一个强启动子，能启动
外源基因的表达
17
天然Ti质粒载体的缺点
分子量太大（200kb），基因工程中难以操作 限制性酶切位点太多，难以找到单一的限制性位点 T-DNA区致瘤基因产物使被转化的植物细胞成为肿瘤，阻碍细胞的分
8
根癌农杆 菌侵染植 物后产生 冠瘿瘤
9
一、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
•Ti质粒(tumor induced Plasmid)是根癌农杆菌染色体外的遗传 物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95--156 x 106 D，约有150--200kb •依据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤种类的不同，Ti质粒可以分为四种 类型：章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型 （agrocinoPine）或琥珀碱型（succinamoPine）
vir 区
tra Ori区
Con区
11
（一）T-DNA的结构特点及功能
编码冠瘿碱的合成，能随机整合 到植物的染色体上。
长度一般为12-24kb，是Ti质粒 最重要的部分。
左右边界分别为25bP的重复序列 ，其中14bP是核心，是完全保守 的。
右边界对于致瘤必不可少。
12
（二）Vir区的结构和功能：
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
2
第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
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毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种
➢ 组成性表达：在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水
平； VirA属于组成型表达的位点
➢ 诱导性表达：即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受 伤组织时，植物细胞分泌的信号分子（乙酰丁香酮及羟基乙酰
10
Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
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第一节 植物遗传转化载体的种类及特点
一、植物遗传转化载体的特点
作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能： 1.能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去 2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，以保 证导入的外源基因能在受体植物细胞中正常复制和表达
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二、植物基因工程载体的种类
7
第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建
根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 名词：一元载体、双元载体、卸甲载体 叶绿体转化的优势与意义 遗传转化中常用的选择标记基因、报告基因
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植物遗传转化的基础
植物遗传转化
也称为转基因技术 (transgene technology) 是指将人工分离和修饰过的外源基因导入生物体的基因组
中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术
15
二、发根农杆菌Ri质粒的结构和功能
Ri质粒：200kb-800kb，其基本结构也与Ti质粒相似，包括致瘤区 （Vir区）、T-DNA区和复制起点Ori。
根据其合成的冠瘿碱种类的不同可分为三类：农杆碱型、甘露碱 型和黄瓜碱型。
农杆碱型Ri质粒有两段T-DNA，即TL和TR，可以分别插入植物基因 组； 甘露碱型和黄瓜碱型Ri质粒只有单一T-DNA，甘露碱型和黄瓜碱型 Ri质粒的单一T区除其25bP边界重复序列外，其他部分与Ti质粒同 源性很低，但它们与农杆碱型Ri质粒的TL区有较高的同源性。
合物（T-DNA-VirD2） VirE蛋白––与单链T-DNA结合（ 形成T复合物），保护T-DNA不被
胞外核酸酶降解转入植物细胞，整合到寄主基因组中 VirC蛋白––与切割单链T-DNA有关 VirF蛋白––协助T-DNA转移到宿主植物细胞中 VirH蛋白对植物产生的杀菌或抑菌物进行解读
该区段上编码的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故也 称作致毒区。T-DNA区与Vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一
Vir区段总长度大约35kb，由6个互补群组成，分别命名为VirA、 VirB、VirC、VirD、VirE、和VirG。
Vir区中各个基因之间都是相互联系相互影响的，缺一不可。 当Vir基因与T-DNA分别位于两个不同的复制子上时，即Vir区与T-
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植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不涉及非目标累赘 基因，因而更具有针对性，可加快育种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制，扩大可利用的资 源库（动物、植物、微生物、人工合成基因均可利用）；
可创造出自然界所没有的新种质； 以转基因植物为主体的植物化工厂具有高效、低污染、可再生的优点。
农杆菌是一类革兰氏阴性土壤杆菌（G－），活在植物根的表面依靠 由根组织渗透出来的营养物质（冠瘿碱）生存的一类细菌。
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
丁香酮）作用下才能启动表达；VirB、VirC、VirD和VirE是属
于诱导性表达的位点
➢ virG既为组成型表达，也具有诱导表达的特性，在信号分子的 诱导下，表达量提高10倍
14百度文库
Vir区基因的功能：
VirA蛋白––帮助植物细胞接受植物信号分子 VirG蛋白––对毒性区的其他基因进行正调节 VirB蛋白––形成膜通道，使T-DNA转移到细菌细胞外 VirD蛋白––VirD1、 VirD2诱导T-DNA形成单股DNA片段，并形成复
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三、Ti质粒载体的改造
Ti质粒作为载体的可能性
能够自发地整合到植物的染色体上 能转化多种植物 强启动子：T-DNA的oPine合成酶基因上有一个强启动子，能启动
外源基因的表达
17
天然Ti质粒载体的缺点
分子量太大（200kb），基因工程中难以操作 限制性酶切位点太多，难以找到单一的限制性位点 T-DNA区致瘤基因产物使被转化的植物细胞成为肿瘤，阻碍细胞的分
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根癌农杆 菌侵染植 物后产生 冠瘿瘤
9
一、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
•Ti质粒(tumor induced Plasmid)是根癌农杆菌染色体外的遗传 物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95--156 x 106 D，约有150--200kb •依据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤种类的不同，Ti质粒可以分为四种 类型：章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型 （agrocinoPine）或琥珀碱型（succinamoPine）
vir 区
tra Ori区
Con区
11
（一）T-DNA的结构特点及功能
编码冠瘿碱的合成，能随机整合 到植物的染色体上。
长度一般为12-24kb，是Ti质粒 最重要的部分。
左右边界分别为25bP的重复序列 ，其中14bP是核心，是完全保守 的。
右边界对于致瘤必不可少。
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（二）Vir区的结构和功能：
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
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第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求