6-高等植物遗传转化系统
第五章 植物基因的遗传转化
主讲：胡银岗植物科学系农学院植物科学系西北农林科技大学农学院西北农林科技大学植物基因受体系统质粒介导基因转化直接导入的基因转化第四节花粉管通道法介导基因转化第五节病毒介导的基因转化第六节植物基因转化系统的选择第七节单子叶植物的基因转化依赖于良好的植物受体系统的建立。
用于转化的外植体（如发苗产生子叶、胚轴等）通过组织培养途径或其它非组织培养途径能高效、稳定地再生无性系接受外源DNA整合对转化选择抗生素敏感植物基因转化受体系统的条件（一）高效稳定的再生能力（二）较高的遗传稳定性（三）具有稳定的外植体来源（四）对选择性抗生素敏感（五）对农杆菌侵染有敏感性（一）高效稳定的再生能力从理论上讲，植物的任何体细胞都具有再生完整植（totipotency）但在组织培养的实践中，并不是所有的体细胞都能再生出完营养生长中心（分生组织）和薄壁细易再生出植株。
再生频率必须具有好的稳定性和重复性。
植物转化频率一般情况下只有0.1%。
基因转化操作，如农杆菌侵染，使用抗菌素筛选及继代培养，都会使转化外植体再生频率降低，有的甚至不能分化，或只能分化形成芽，而难以形成植株。
若只有10%再生率，则转化率10% ×0.1% = 0.01%后不影响其分裂和分化，并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性，尽量减少变异。
不因导入优良性状的目的基因，使原有的目的性状（优良性状）在后代发生了变异。
注意组培过程（组培方法，再生途径及外植体基因型）引稳定的外植体来源，即外植体容易得到并且可以大量提供。
因基因转化的频率很低，需要多项反复地实验，所以就需要大量的外植体材料。
转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等，或采用快速无需复杂的培养和繁殖操作过程，数量亦多；接种前的无菌处理简便易行；一些植物可由无菌幼苗形成愈伤组织和再生植株；无需保持无菌苗的无性系，只要有种子，随时可大量培养已适应组织培养条件，有利于外植体转化生长；可直接采用、无需消毒；材料来源量大而稳定。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(3639)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（100分，每题5分）1. 非循环式光合磷酸化既可产生ATP，也可产生O2和NADPH。
（）答案：正确解析：非循环式光合磷酸化电子沿Z形传递，直至NADP＋产生NADPH，电子传递过程中产生的H＋浓度差推动ATP的生成，同时分解H2O分子产生O2。
2. 所有核酸的复制都是在碱基互补配对的原则下进行。
（）答案：正确解析：3. 人体内若缺乏维生素B6和维生素PP，均会引起氨基酸代谢障碍。
（）解析：4. 原核生物和真核生物的染色体均为DNA与组蛋白的复合体。
（）[四川大学2015研]答案：错误解析：真核生物的染色体为DNA与组蛋白的复合体，而原核生物的染色体为DNA与碱性精胺、亚精胺结合。
5. 真核细胞的基因转录也具有抗终止作用。
（）答案：正确解析：抗终止作用即是转录水平上的通读，某些真核细胞基因的转录可在特定的条件下可以发生这种现象。
6. 2,4二硝基苯酚（DNP）可解除寡霉素对电子传递的抑制。
（）答案：正确解析：2,4二硝基苯酚（DNP）是一种解偶联剂，它可使呼吸链上的电子流动与氧化磷酸化失去偶联关系。
本来寡霉素是通过抑制氧化磷酸化而间接抑制电子流动的。
当氧化磷酸化与呼吸链不再偶联的时候，寡霉素将丧失对电子流动的抑制作用。
7. 放线菌素D既能抑制DNA的复制，又能抑制转录。
（）解析：8. 氨基酸活化时，在氨酰tRNA合成酶的催化下，由ATP供能，消耗一个高能磷酸键。
（）答案：错误解析：9. 嘧啶环和嘌呤环在分解代谢中均被水解开环，且降解产物均易溶于水。
（）答案：错误解析：嘧啶环分解过程中开环，降解产物易溶于水。
但嘌呤环不同。
10. 原核生物中的三种终止与释放因子分别识别三种终止密码子。
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。
一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。
常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。
1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。
该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。
首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。
在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。
2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。
将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。
在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。
3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。
通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。
二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。
常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。
1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。
它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。
在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。
通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。
步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤
植物遗传转化是指通过人为手段，将外来基因导入植物细胞内，使其产生新的遗传特征。
植物遗传转化的步骤主要包括以下几个方面： 1. 基因载体构建：基因载体是将所需基因导入植物细胞内的载体，包括质粒、病毒、人工染色体等。
构建基因载体需要选择适当的载体和适合的启动子、终止子、选择标记等元件。
2. 转化体系建立：植物遗传转化需要建立一套合适的转化体系，包括培养基的配制、细胞培养和再生体系等。
转化体系的搭建需要考虑到不同物种、基因载体和转化方法的特点。
3. 基因导入：基因导入可以通过直接基因转移、基因炮击、农
杆菌介导转化等手段进行。
其中，农杆菌介导转化是最常用的基因导入方法。
在基因导入过程中，可以使用选择标记来筛选生产基因转化植株。
4. 识别和筛选：基因转化后的植物细胞需要进行识别和筛选。
常用的识别方法包括PCR检测、Southern杂交、Northern杂交等。
筛选方法可以通过细菌耐草酸和遗传标记等手段进行。
5. 品系选育：经过基因转化的植物需要进行品系选育，通过选
择有利的基因型和表型，后代将具有更好的遗传特征。
品系选育需要进行多代重复筛选，最终得到具有稳定表达和优良性状的转化植株。
6. 安全评价：基因转化后的植物需要进行安全评价，包括对植
物生长性状、代谢产物、土壤微生物等方面的评价。
安全评价是确保基因转化植物的生态安全性和食品安全性的重要环节。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(2972)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（100分，每题5分）1. 在正常情况下，人体蛋白质的合成与分解处于动态平衡。
（）答案：正确解析：2. 细胞的区域化在代谢调节上的作用，除了把不同的酶系统和代谢物分隔在特定的区间，还通过膜上的运载系统调节代谢物、辅酶和金属离子的浓度。
（）答案：正确解析：3. 只有直接消耗ATP的物质运输才是主动运输。
（）答案：错误解析：协同运输是一类靠间接提供能量完成的主动运输方式。
4. 据测定，多莉羊（sheep Dolly）的端粒长度比正常生殖的同龄羊的端粒长度短。
（）答案：正确解析：据测定多莉羊的端粒长度只有正常生殖的同龄羊的端粒长度的80。
5. 脂肪酸的活化在细胞胞液进行，脂肪酰CoA的β氧化在线粒体内进行。
（）答案：正确解析：6. 线粒体DNA的复制需要使用DNA引物。
（）答案：错误解析：线粒体DNA为双链环状分子（纤毛虫的线粒体DNA除外），其复制方式为D环式，复制的引物为RNA。
7. 在蛋白质合成中，核糖体中的rRNA只起结构骨架的作用，其他功能均是由核糖体的蛋白质提供的。
（）答案：错误解析：8. 凡能转变为丙酮酸的物质都是糖异生的前体。
（）答案：正确解析：9. 密码子的简并性减少了蛋白质突变的频率。
（）答案：正确解析：10. 线粒体内膜上的复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中均含有FeS蛋白。
（）答案：错误解析：复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均含有FeS蛋白，但复合体Ⅳ缺乏FeS蛋白。
11. 用烟草花叶病毒构建植物表达载体时，外源基因可直接插入其基因组中，然后感染植物细胞，并在植物细胞中高水平表达。
（）答案：错误解析：因烟草花叶病毒为单链RNA病毒，应首先将其RNA逆转录成cDNA。
12. 碳三植物叶片的叶肉细胞所含的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶对CO2有很强的亲和力，所以碳三植物利用CO2能力很高，是高产植物。
植物遗传转化及其农业应用
植物遗传转化及其农业应用植物遗传转化是指将外源基因或DNA序列稳定地导入植物细胞或组织，并使其遗传表现进行改变的技术。
随着这项技术不断发展和完善，越来越多的植物种类被进行遗传转化，其应用也越来越广泛。
在农业生产领域，植物遗传转化技术被广泛应用，如提高农作物的生产力、耐旱、耐盐等性状，研发新品种等，对于推进农业现代化起到了重要作用。
一、植物遗传转化技术及其分类植物遗传转化技术可分为两类：直接转化和间接转化。
直接转化是指将外源DNA直接导入植物细胞或组织，利用种种手段促使外源DNA整合入植物基因组，从而改变其遗传表现。
直接转化分为生理、物理和化学三种方法。
生理方法是将植物组织培养在含有激素和其他化合物的培养基上，使其形成愈伤组织和再生植株，再利用农杆菌或冷杆菌等载体导入外源DNA。
物理方法是利用生物粒子枪，通过高速粒子冲击将DNA导入植物细胞或组织中。
化学方法是利用钙离子或聚乙烯醇等高分子材料电转化植物细胞或组织。
间接转化是指将外源基因先导入细菌或酵母等微生物细胞中，再利用这些细胞的载体介导导入植物细胞或组织中，使其发生遗传改变。
间接转化主要的手段是农杆菌介导转化。
农杆菌T-DNA 的导入具有高效、选择性和可重复性等优点，因此也是植物遗传转化中最常用的技术。
二、植物遗传转化在农业生产中的应用1. 提高农作物产量和品质通过基因工程技术对农作物进行遗传改良，可以提高作物产量和品质。
例如，利用玉米中的赤霉烯合成酶基因调控葡萄果实的脱落酸合成，可以延长果实的寿命和保留其营养成分，提高果实的品质；利用独苗菜中的β-半乳糖苷酶基因使西瓜果肉中木瓜素和木瓜苷的含量降低，从而提高西瓜的口感和品质。
2. 研发新品种通过植物遗传转化技术，可以引入新的基因或遗传材料，从而研发新的品种。
例如，将水稻中的鱼腥草酸合成酶基因导入玉米中，产生了抵抗昆虫的转基因玉米；将独苗菜中的组氨酸脱羧酶基因引入番茄中，产生了抗沙漠化的转基因番茄。
植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
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病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进 行复制和表达；同时又由于病毒具有高效自我复制能力，故在转 化植物中可得到高拷贝外源基因，从而十分有利于外源基因的表 达和功能的实现
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Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
2
第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
含子、信号肽等）连接在一起构成基因。
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启动子
Ti质粒
Nos（胭脂碱合成酶基因）、Ocs（章鱼碱合成酶基因）等
基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植 物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建 嵌合基因的启动子。
大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用
大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用一、引言大豆（Glycine max）是我国的主要农作物之一，其种子含有丰富的优质蛋白质和油脂，被广泛用于食品加工、饲料生产和生物能源开发等领域。
然而，提高大豆的产量和抗逆性一直是大豆育种领域面临的挑战。
为了解决这一问题，科研人员不断努力，建立了大豆瞬时转化体系和遗传转化体系，并将其应用于大豆育种中，取得了显著的成果。
二、大豆瞬时转化体系的建立与应用1. 大豆瞬时转化体系的概念及原理大豆瞬时转化体系是指利用农杆菌介导法将外源基因导入大豆离体部分，经瞬时表达后再转移到植株体内的一种转化技术。
该技术的核心原理是通过利用农杆菌的T-DNA片段将目的基因导入大豆受体细胞，利用激素和植物生长物质的作用，实现外源基因在大豆植株体内的转化和表达。
大豆瞬时转化体系的建立为大豆遗传改良提供了重要的技术手段。
2. 大豆瞬时转化体系的应用进展利用大豆瞬时转化体系，科研人员已经成功地转化了多种外源基因，并将其导入大豆植株体内。
通过该技术，不仅可以实现外源基因在大豆植株体内的高效表达，还可以实现特定基因的靶向编辑和调控。
利用大豆瞬时转化体系成功导入了抗病基因、抗逆基因和营养改良基因等，为大豆的抗病、抗旱、抗寒和产量性状的改良提供了重要的技术支持。
三、大豆遗传转化体系的建立与应用1. 大豆遗传转化体系的概念及原理大豆遗传转化体系是指利用基因编辑技术，通过CRISPR/Cas9系统等工具对大豆基因组进行精准编辑和改造的一种转化技术。
该技术的核心原理是利用CRISPR/Cas9系统的靶向特异性，将Cas9蛋白和RNA 导向的DNA裂解酶导入大豆细胞内，通过靶向编辑特定基因，实现对大豆遗传特性的调控和改良。
2. 大豆遗传转化体系的应用进展近年来，大豆遗传转化体系的应用进展迅速，科研人员已经成功地利用CRISPR/Cas9系统对大豆的多种性状进行精准编辑和改良。
通过该技术，不仅可以实现对大豆产量、品质和抗逆性状的调控，还可以实现对大豆次生代谢途径和生长发育过程的精准编辑。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前，首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象，而目标基因则是具有特定功能的基因，如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介，通常由DNA序列构成。
在构建载体时，需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并加入其他必要的DNA片段，如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中，然后利用农杆菌侵染植物组织，将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后，需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株，常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性，在培养基中添加相应抗生素或除草剂后，只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后，需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长，以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后，需要对其进行鉴定，确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法，可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功，就可以进行后续的分子生物学和生理学分析，如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外，转化植株也可以用于基因工程和农业生产中，如改良作物品质、提高产量等。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(52)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（95分，每题5分）1. 萌发的油料种子和某些微生物拥有乙醛酸循环途径，可利用脂肪酸α氧化生成的乙酰辅酶A合成苹果酸，为糖异生和其他生物合成提供碳源。
（）答案：错误解析：萌发的油料种子和某些微生物拥有乙醛酸循环途径，利用乙醛酸循环将乙酰CoA转化成琥珀酸，由琥珀酸再生成草酰乙酸而进入生糖途径。
2. 脂酸的氧化降解是从分子的羧基端开始的。
（）答案：正确解析：3. 线粒体内的翻译系统中，第一个被掺入的氨基酸都是甲酰甲硫氨酸。
（）答案：错误解析：哺乳动物线粒体翻译的蛋白质第一个氨基酸不是甲酰甲硫氨酸。
4. 原核生物基因转录时，第一个磷酸二酯键形成以后，α因子与全酶解离，转录从起始状态转入延伸状态。
（）答案：错误解析：实际上在合成大约十聚核苷酸以后，σ因子才与RNA pol全酶解离，RNA pol开始移位，转录进入延伸阶段。
5. 葡萄糖磷酸变位酶既参与糖原合成，又参与糖原分解。
（）答案：正确解析：6. 脂肪酸彻底氧化产物为乙酰CoA。
（）答案：错误解析：脂肪酸彻底分解的过程是先经β氧化作用生成若干个乙酰CoA，生成的乙酰CoA再由三羧酸循环氧化生成二氧化碳和水。
7. 糖酵解过程在有氧无氧条件下都可进行。
（）答案：正确解析：8. 脂肪酸活化为脂肪酰CoA时，需消耗两个高能磷酸键。
（）答案：正确解析：脂肪酸的活化过程需消耗1molATP，但消耗2个高能磷酸键，也相当于消耗2molATP。
9. 在正常情况下，人体蛋白质的合成与分解处于动态平衡。
（）答案：正确解析：10. 反转录病毒都是肿瘤病毒。
（）答案：错误解析：HIV是一种反转录病毒，但并不是肿瘤病毒。
11. 当溶液的pH升高时，ATP水解释放的自由能明显增高。
叶绿体遗传转化系统及其应用进展
叶绿体遗传转化系统及其应用进展引言：叶绿体是植物细胞中的一种重要细胞器，它在植物的光合作用中起着至关重要的作用。
叶绿体内含有自己的独立基因组，称为叶绿体基因组，与细胞核基因组合作编码控制植物的生长和发育。
在过去的几十年中，科学家们通过基因工程技术，成功地开发出了叶绿体遗传转化系统，这一系统在植物遗传改良、药物生产和生物能源领域中有着广泛的应用前景。
本文将针对叶绿体遗传转化系统及其应用进展进行深入探讨。
一、叶绿体遗传转化系统的基本原理叶绿体遗传转化是指将外源基因导入到植物叶绿体基因组中，使其表达并产生相应的功能蛋白质。
叶绿体遗传转化的基本原理是利用叶绿体自身的自主复制和表达机制，将外源基因整合到叶绿体基因组中，并使其在叶绿体内表达。
在进行叶绿体遗传转化时，常用的手段包括质粒介导转化、基因枪转化和准叶绿体载体介导转化等。
1.1 质粒介导转化质粒介导转化是指将植物叶绿体基因组的片段构建到质粒载体中，然后通过介导元件将质粒导入目标植物细胞中，利用细胞内自主复制和表达机制使其整合到叶绿体基因组中。
质粒介导转化是叶绿体遗传转化的最早方法之一，其优点是操作简便，适用范围广泛，但也存在转化效率低、选择压强等问题。
1.2 基因枪转化基因枪转化是利用高压气体或金属微粒等物理手段将外源DNA导入到植物叶绿体中，并使其整合到叶绿体基因组中。
基因枪转化在叶绿体遗传转化中具有较高的转化效率和广泛的适用性，但也存在叶绿体损伤、转化杂质及基因组随机整合等问题。
上述三种叶绿体遗传转化方法各有优缺点，其在实际应用中可以根据具体的研究目的和条件进行选择。
二、叶绿体遗传转化系统在植物遗传改良中的应用叶绿体遗传转化系统在植物遗传改良中具有广泛的应用前景，可以通过引入外源基因来改良作物的抗逆性、产量和品质等性状。
通过叶绿体遗传转化可以向植物导入耐盐碱、抗病虫、耐干旱等特定基因，提高植物对环境胁迫的适应能力，增加作物产量和品质，进而改良作物品种。
植物遗传转化体系的建立
8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
学习后的感受：
1.植物遗传转化受体？
2.植物遗传转化方法？ 3.转基因植株的再生？
4.转基因植株的检测？
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体
所谓基因转化受体是指用于转化的外植体通过组织培养途径
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.5 叶圆片
叶圆片 ( 叶盘 ) 是农杆菌转化的主要受体。采取新鲜 植株上无菌的幼嫩叶片，用打孔器或解剖刀切取直径 35mm的叶圆片，在液体培养瓶中与农杆菌共培养20-30min， 其间轻轻摇动使农杆菌从切口侵入叶片。然后将共培养 后的叶圆片在滤纸上吸干，转移到非选择性培养基上培 养 3d ，再转入含卡那霉素或羧苄青霉素等抗生素的选择 培养基上培养，诱导植株再生，这样可获得遗传均一性 较高的转基因植株。
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体 8.1.1 原生质体 原生质体是无细胞壁的细胞。与悬浮细胞一样，被转化的受体是 单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。 水稻广亲和品种‘02428’的原生质体用聚乙二醇(PEG)法导入具 有潮霉素 B(HPT) 抗性基因、卡那霉素抗性基因 (KanR) 和昆虫荧光素 酶 基 因 (Luc) 的 质 粒 pTHL27DNA ， 在 含 有 25μg/ml 潮 霉 素 B 和 100μg/ml卡那霉素的培养基KPR和N6上连续培养处理4周，可以很好 地除去非转化的敏感的原生细胞；然后在无抗菌素选择压力的培养 基中，转化细胞可再生植株(杨歧生等， 1996)。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(2773)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（95分，每题5分）1. 遗传密码的变偶性（可变性）是指密码子的第1位碱基比其他两个碱基在识别反密码子时具有较小的专一性，这样反密码子的第3位碱基则可有最大的阅读能力。
（）[山东大学2017研]答案：错误解析：遗传密码的变偶性（可变性）是指密码子的第3位碱基比其他两个碱基在识别反密码时具有较小的专一性，这样反密码子的第1位碱基则可有最大的阅读能力。
2. 阿莫西林的抗菌机理是阻止肽聚糖的合成。
（）[浙江大学2018研]答案：正确解析：阿莫西林是青霉素类抗菌药物，主要抑制细菌细胞壁中肽聚糖的合成。
3. 氨基酸活化时，在氨酰tRNA合成酶的催化下，由ATP供能，消耗一个高能磷酸键。
（）答案：错误解析：4. 糖酵解过程无需O2参加。
（）答案：正确解析：5. 高等生物基因组内含有大量不编码蛋白质的序列，因此基因组的大小与其进化程度并不一一对应。
（）[浙江大学2010研]答案：正确解析：在真核生物中，每种生物的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，称为C值。
C值一般随生物进化而增加，真核生物基因组中含大量非编码序列，因此可能存在某些低等生物的C值比高等生物大，即C值反常现象。
6. 丙酮酸脱氢酶系中电子传递方向为硫辛酸→FAD→NAD＋。
（）答案：正确解析：丙酮酸脱氢酶系中，二氢硫辛酸脱氢酶氧化二氢硫辛酸，并将氢交给其辅基FAD，FADH2再使NAD＋还原，因此电子传递方向为硫辛酸→FAD→NAD＋。
7. RNA聚合酶能以两个方向同启动子结合，并启动相邻基因的转录。
但是，模板链的选择由另外的蛋白因子确定。
（）答案：错误解析：8. 细胞水平的调控是一种最原始、最基础的调控机制。
（）答案：错误解析：9. DNA的复制方式多样，通常双向进行的，但滚动式复制是环状DNA一种特殊的单项复制方式。
某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(88)
某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（100分，每题5分）1. 一个细菌只有一条双链DNA，人的一个染色体含有46条双链DNA。
（）[山东大学2016研]答案：错误解析：人的一个体细胞含有46条双链DNA，一个染色体仅含有1条双链DNA。
2. 真核细胞中的RNA聚合酶仅在细胞核中有活性。
（）答案：错误解析：RNA聚合酶在细胞质中也有活性。
3. DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ都属于多功能酶。
（）答案：错误解析：4. 嘧啶环和嘌呤环在分解代谢中均被水解开环，且降解产物均易溶于水。
（）答案：错误解析：嘧啶环分解过程中开环，降解产物易溶于水。
但嘌呤环不同。
5. 琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中唯一掺入线粒体内膜的酶。
（）答案：正确解析：6. 一般来讲，真核生物单顺反子mRNA就是一个初级RNA转录物。
（）答案：正确解析：7. 含硒半胱氨酰tRNA是由游离的含硒半胱氨酸与tRNASec合成而来。
（）答案：错误解析：细胞中并无游离的含硒半胱氨酸，SectRNASec是由SertRNASec经过修饰产生的。
8. IF3作为蛋白质合成的起始因子，可以促进核糖体小亚基与大亚基的结合。
（）答案：错误解析：9. 氨酰tRNA合成酶都是单体酶。
（）答案：错误解析：氨酰tRNA合成酶分为两类，第一类是单体酶，第二类是寡聚酶。
10. 生物膜上的糖蛋白的糖链部分往往分布在质膜内侧。
（）答案：错误解析：生物膜上的糖蛋白的糖链部分往往分布在质膜外侧。
11. 密码子的简并性减少了蛋白质突变的频率。
（）答案：正确解析：12. 腺嘌呤核苷酸循环不能脱去氨基。
（）[中国科学院水生生物研究所2013研]答案：错误解析：腺嘌呤核苷酸在腺苷酸脱氨酶作用下脱掉氨基又生成次黄嘌呤核苷酸。
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叶绿体基因工程的优越性
1 高效表达目的基因 2 安全性好 (母系遗传，不可能通过花粉扩散) 3 消除位置效应（定点整合） 4 无基因沉默现象（无位置效应、甲基化少） 5 原核基因表达方式 6 适宜的表达环境 具双层膜的细胞器，形成独立的小环境；叶绿体对 物质积累具较强的承受能力；产物区域化，便于提取。
2 花粉介导法：收集成熟花粉，基因枪等转化 花粉，后用转化后的花粉授于成熟的柱头上， 最后搜集成熟的种子。 优点：避开组织培养再生的过程，技术简单， 不需要装备精良的实验室，适合于难以再生 的植物，常规育种工作者易于掌握 。 缺点：技术尚不成熟；筛选工作量大，转化效 率较低。
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影响基因枪法遗传转化的因素
根据植物的种类不同，所选择的最
佳轰击材料不同。
不同类型的品种，其转化频率也不相同。 同一品种来源的不同时期愈伤组织，转化频率也不尽相 同。
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轰击前后的培养条件
在对材料轰击前，进行预培养、高渗处理及轰击后 的继续高渗处理，延迟筛选都可以提高基因枪法的 转化频率。 轰击后的材料，在一定的时间内只进行抑菌培养而 不进行筛选，对转化频率有一定的影响，因为轰击 对材料造成的机械的损伤，轰击后需要一段时间的 损伤修复。
植物病毒可以感染植物寄主细胞，并进行复制和表达植物外源 DNA。利用植物病毒的特性有希望发展成为一种有价值的植物 遗传转化体系。 优点： 部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，可扩散到寄主所有 细胞，故无需组培再生； 可对单子叶植物进行高效浸染； 病毒感染的植物能够繁殖大量病毒颗粒，有望大量生产外源 蛋白。
2. 叶绿体基因工程原理：通过一定方法使外源基因穿过细胞膜 和叶绿体双层膜进入叶绿体，在两端同源片段的介导下与叶 绿体基因组之间发生同源重组，以定点整合的方式插入到叶 绿体基因组，在其中表达。
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叶绿体基因工程内容 1 将外源DNA送入叶绿体
主要通过基因枪转化法
第六讲 高等植物遗传转化系统
The System for Plant Gene Manipulation
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高等植物遗传转化系统
农杆菌介导转化方法 直接转化（理化法） 病毒感染
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病毒载体介导的植物遗传转化
四 显微注射转化法
利用显微装置将大分子物质（DNA）或细胞器注 射到培养细胞中。最初主要由于动物，80年代中后 期开始用于植物遗传转化。用微毛细管在显微镜下 将外源DNA导入特定细胞，并使其成活、增殖。 技术要点：注射针直径要细（1uM）;选择生长旺盛 的胚性细胞；注射细胞核；进行微培养法。 优点：可精细选择受体细胞，并直接导入细胞核。 缺点：工作效率低，需要特殊显微操作系统，操作 复杂。 2016/2/22 IMAU, Huo XW
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三 生殖细胞原位转化法
植物生殖细胞指雌雄配子体中形成的或参与生殖 过程的有关细胞，如大小孢母细胞、卵细胞与花粉。 生殖细胞原位转化法利用天然繁殖过程为转化系统 进行遗传转化。 1 花粉管通道法：周光宇（1981）首先提出，之后 有不少改良。使子房预先充分授粉，在授粉后至合 子分裂之前，通过花柱断面滴加或子房注射，使外 源DNA到达培囊，搜集成熟种子，筛选转基因植株。 我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉 管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组 2016/2/22 IMAU, Huo XW 9 织培养人工再生植株，
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五 激光微束穿刺法
利用激光微束（0.3-0.5uM）射击靶细胞，引起可逆性穿孔， 从而直接导入外源DNA。首先在动物与人的细胞中获得成功， 80年代后期用于植物。 技术原理：激光照射系统产生高能量激光脉冲，照射经高渗处 理的材料，产生穿孔后，外源DNA向靶细胞渗入。然后培养靶 组织，产生转化植株。 优点：可瞄准靶细胞定位导入外源DNA，与其他方法比较对靶 细胞损伤小、恢复快。单、双子叶植物均可，受体细胞可以是 花粉、单细胞或组织、器官。 缺点：需要相应昂贵的设备，穿刺处理速度较慢。
微针注射法 原生质体 无 复杂 无 复杂 昂贵 低 可行
基因枪法 花粉管通道法 完整细胞 无 简单 多 复杂 昂贵 高 广泛 卵细胞 有性繁殖植物 无 无 简单 便宜 低 广泛
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七 叶绿体基因工程
1. 叶绿体本身为半自主复制，大部分组分有核基因组编码。叶 绿体基因组为双链环状分子，约120-217kb，编码120-160个 基因。单个叶绿体中含20-900个拷贝。叶绿体基因组显著特 点为具反向重复序列，大小约6-67kb。
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PDS-1000
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一种手持基因枪
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基因枪转化流程
表达载体构建
微弹制备
装弹
ห้องสมุดไป่ตู้
轰击
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转基因植株
IMAU, Huo XW 分 化
组培
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常用植物基因转化方法特点比较
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烟草叶绿体转基因载体（图例）
叶绿体基因组
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表达载体
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八 转基因沉默
外源基因在转基因植物中表达受抑制的现象 为转基因沉默，表现为表达不稳定、表达量低 甚至完全不表达。 转录水平 transcriptional gene silenceing, TGS
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基因枪的轰击参数
DNA的浓度 DNA的沉淀剂 微弹的速度、射程和轰击次数 微弹的用量 培养基成分 微弹粒径 样品室高度 样品室内真空度 2016/2/22 IMAU, Huo XW 轰击前的辐照剂处理
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基因枪转化操作
微靶点射击
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无需载体，将DNA与金属颗粒混合为小液滴，压缩气体为动力轰击。 IMAU, Huo XW
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基因枪转化法的影响条件
1 DNA：高纯度的DNA；质粒或裸露DNA 片段大小在 2025 kb 以內都可以；DNA浓度2ug/mg钨粒；加入携带DNA （4-6kb小牛胸腺或鲑鱼精DNA）。 2 金属粒的选择：金粒、钨粒。钨粒子较小也较便宜， 但形状不规则，对某些细胞具毒性；金粒子呈圆球形， 大小均匀，在经费许可下，可使用金粒子。金属粒越大， 速度及穿透力也越大。 3 微弹速率：样品与微弹间距、压力、真空度。 4 DNA沉淀剂：氯化钙、亚精胺、聚乙二醇等。 IMAU, Huo XW 15 5 2016/2/22 植物材料受体:
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六 PEG介导法
PEG为化学渗透剂，通过改变细胞膜的通透性促 使外源DNA进入靶细胞。所引起的膜透性可以恢复， 但引起的外源DNA进入机制尚不清楚。 技术原理：首先获得原生质体，并有相应的组培再 生体系。在一定渗透压体系内将外源DNA直接导入。 改进的方法有（1）脂质体法，将外源DNA与脂质体 （磷脂双分子膜）的复合体用于转化；（2）电击法 与PEG法相结合等，可提高转化效率。 特点：由于原生质体及相应的组培体系的获得较难， 且培养周期长、细胞遗传背景易变异，故 PEG法使用 2016/2/22 IMAU, Huo XW 13 日趋减少。
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一 基因枪转化法
又称微弹射击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道 微靶点射击，将载有外源DNA的金属（钨或金）经驱动后通 过真空小室进入靶组织的一种遗传转化技术。 采用的基因枪分为火药引爆、高压放电、压缩气体等。 1987年美国康奈尔大学的Sanford首次用于植物遗传转化。 可用受体范围广泛，单、双子叶植物均可，许多单子叶植物 遗传转化的主要方法。 基因枪价格昂贵，转化成本较高，轰击过程对细胞损害较大， 转化效率有待进一步提高。
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缺点：
目前对植物病毒分子生物学研究十分初浅，还 不能建立有效遗传转化体系。迄今为止，植物病毒 载体尚未发展到可以广泛使用的阶段。
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重组双子座病毒载体系统感染植物示意图
外壳蛋 白基因
DNA A
DNA B
NPT II
转化方法 受体材料 宿主范围 组培条件 嵌合体比例 操作复杂性 设备要求 工作效率 单子叶植物应 用
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农杆菌法 完整细胞 有 简单 有 简单 便宜 高 少
PEG法 原生质体 无 复杂 无 简单 便宜 低 可行
电击法 原生质体 无 复杂 无 复杂 昂贵 低 可行
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转录后水平
post- transcriptional gene silenceing, PTGS
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转基因沉默机制
转录水平的基因沉默 Transcriptional Gene Silencing,TGS 转基因无法被顺利转录成相应的RNA而导致 基因沉默 转基因及其启动子甲基化 多拷贝重复转基因序列引起的转录水平基因沉默 同源基因间的反式失活 转基因位置效应
基因枪及动力源的类型
火药爆炸轰击载体
塑料子弹为载体，火药爆炸为动力，挡板阻挡塑料载体，而金属子弹高速 轰击靶细胞。