分子生物学检验技术第8章

二、杂交的基本分类
1.菌落杂交
2.Southern blot
DNA片段在琼脂 糖凝胶上电泳分 离
DNA片段从琼脂 糖凝胶上转印到 膜上
杂交信号的 检测
在缓冲液中将 标记的探针加 到膜上
膜上固定DNA 片段
二、杂交的基本分类
3.Northern印迹杂交
二、杂交的基本分类
DNA样品点到滤膜上 探针DNA 探针标记 1 变性 2 中和 3 固定DNA 变性
• 三体分析
• 染色体作图 • 分裂间期研究 • 产前诊断 • CGH
Metaphase Chromosom 1, FITC Chromosom 12, TRITC Chromosom 17, FITC and TRITC
FISH显微摄影术
间期细胞核 FITC/TRITC Double Filterset 24
一、设计原理
（二）标记方法 1.探针标记物的选择
放射性标记
非放射性标记
一、设计原理
2.探针标记方法的选择
随机引物标记
DNA缺口平移标记 全程RNA探针标记 化学法全程标记 3′末端标记 5′末端标记
一、设计原理
随机引物标记
DNA模板
引物和模板DNA结合 加入klenow片断、3种 dNTP和1种标记dNTP 引物延伸
三、信号检测
间接放射自显影
三、信号检测
与地高辛标记的 探针杂交
BCIP/ NBT 加入 底物
加入与碱性磷酸酶结 合的抗地高辛抗体
CSPD
第四节
核酸分子杂交技术的应用
第四节
核酸分子杂交技术的应用
一、Southern杂交技术
二、Northern杂交技术
三、原位杂交技术 四、液相杂交技术
一、 Southern杂交技术
分裂中期和间期 FITC/TRITC/DAPI Triple Filterset 25
多种荧光数码片
Human Chromosome 5 6 Cosmid Clones by courtesy of Th. Ried
24 色荧光原位杂交或 M-FISH
分裂中期
核型
杂交技术临床应用总结 DNA
出生缺陷干预工程 • 唐氏综合征 • 地中海贫血 • 神经管缺损 • 苯丙酮尿症 • G6PD SNPs 感染性疾病的鉴别诊断 药物敏感性 亲子鉴定
4.点杂 交和狭 缝杂交
将探针加到固定的DNA上
4 与标记探针杂交 5 洗脱与显影
二、杂交的基本分类
5.荧光原位杂交
二、杂交的基本分类
6.基因芯片
第二节
探针的设计与标记
第二节
探针的设计与标记
（一）探针种类的选择 （二）标记方法
一、设计原理
（一）探针种类的选择 DNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
3 618 T→C
3 394 T→C
3 593 T→C
3 290 T→C
四、液相杂交技术
Northern杂交对基因代表水平的检测
病人组 对照组
靶基因
GAPDH
FISH，荧光原位杂交
应用
• DNA染色体分析
Nucleoli Chromosom 13q14, FITC Chromosom 21, TRITC
第八章
核酸分子杂交技术
郑 芳
武汉大学ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第八章
第一节
第二节
核酸分子杂交技术
核酸杂交的基本原理与分类
探针的设计与标记
第三节
第四节
分子杂交
核酸分子杂交技术的应用
第一节
核酸杂交基本原理与分类
第一节
核酸杂交的基本原理与分类
一、核酸分子杂交的基本原理
二、杂交的基本分类
第一节
核酸杂交的基本原理与分类
• 单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互 补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸
分子杂交
• 利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸
分子杂交技术
一、核酸分子杂交的基本原理
变性
复性
一、核酸分子杂交的基本原理
DNA加热变性
DNA冷却复性
DNA/RNA杂交
二、杂交的基本分类
（一）液相杂交
（二）固相杂交
（三）原位杂交
点杂交/狭缝杂交 菌落杂交 Northern 杂交 Southern杂交
孵浴15min；随后滤膜在新配制的42C预热的
0.1SSC和0.1%SDS溶液中孵浴15min；用2SSC的
溶液短暂漂洗滤膜，将滤膜置于一纸巾上
三、信号检测
（一）放射自显影
（二）非放射性杂化分子的检测
三、信号检测
（一）放射自显影 1.直接放射自显影
2.间接放射自显影
三、信号检测
（二）非放射性杂化分子的检测 1.直接检测 2.间接检测 3.显色底物检测 4.化学发光底物检测 5.多探针检测
二、杂交
1.预杂交 2.杂交 3.洗脱
二、杂交
杂交的基本程序
• 预杂交：
滤膜在68C的预杂交（含鲑鱼精DNA）
溶液中水浴1h
• 杂交： 将变性探针加入杂交溶液，在42C孵浴8h
二、杂交
• 洗脱： 滤膜浸入2SSC和0.1%SDS溶液中，室温孵浴
5min，再至预热的0.1SSC和0.1% SDS中，于42C
一、设计原理
模板DNA
DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ （5’－3’核酸外切酶活性）
DNA 缺 口 平 移 标 记
DNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性 5’－3’ 聚合酶活性）＋3dNTP＋1dNTP#
切开模板DNA形成一到 几个碱基的缺口
DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外 切酶活性5’－3’ 聚合酶活性）
（一）单基因遗传病的基因诊断
（二）基因突变的检测
二、Northern杂交技术
（一）RNA病毒的检测
（二）基因表达的检测
三、原位杂交技术
（一）细胞遗传学分析
（二）比较基因组杂交 （三）基因图谱绘制 （四）病原学检测
四、液相杂交技术
线粒体DNA的8个突变位点膜杂交结果
3 256 C→T 3 316 G→A 3 688 G→C 3 316 G→A 3 606 A→G
RNA
肿瘤的分子病理学 • 血液病 • 乳癌 • 肝癌 • 胃癌 • 肺癌 • 膀胱癌 • 结肠癌
32p—dNTP
3’
5’末端突出的DNA
5’ 3’ 变性
3’ 5’
3’末端标记的DNA
32p末端标记的 单链DNA探针
3’-末端标记
第三节
分子杂交
第三节
分子杂交
一、核酸分子与固相介质的结合 二、杂交 三、信号检测
第三节
分子杂交
紫外交联仪进行核酸固定
一、核酸分子与固相介质的结合
1.支持介质的类型和性质 2. 核酸分子的转移 3.核酸的固定
（四）基因芯片技术
MASA液态芯片
二、杂交的基本分类
MASA技术的原理是 用不同的荧光颜色 对乳胶颗粒进行编
码使之具有检测多
个靶分子的能力
二、杂交的基本分类
二、杂交的基本分类
二、杂交的基本分类
二、杂交的基本分类
二、杂交的基本分类
二、杂交的基本分类
1.菌落杂交
2.Southern blot 3.Northern blot 4.点杂交和狭缝杂交 5.荧光原位杂交 6.基因芯片
掺入标记基团
缺口平移
一、设计原理
全程RNA探针标记
在△处酶切
在◆处酶切
从T7启动子转录
从SP6启动子转录
一、设计原理
化学法全程标记
与地高辛标记的探针杂交
BCIP/ NBT 加入 底物
加入与碱性磷酸酶结合的 抗地高辛抗体
CSPD
一、设计原理
末端标记
完整双链DNA
5’
3’
5’ KlenowDNA聚合酶