沙门氏菌的检测方法

ＧｕｉｄｅｔｏＣｈｉｎｅｓｅＰｏｕｌｔｒｙ

２００６年第２３卷第２４期

禽业园地

近年来，沙门氏菌食物中

毒和动物感染沙门氏菌十分严重。由肠炎沙门氏菌引起人的急性胃肠炎，在世界各国有增加的趋势，已成为国际公共卫生的一个重要课题。沙门氏菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫中均有重要意义。下面就对沙门氏菌的检测方法进行简单的介绍。

一常规方法

从病料中分离培养为基础的常规方法，对这种方法的相关研究较多。虽然该方法是迄今为止最确实的方法，但由于沙门氏菌常在肠系膜和膜淋巴结中而不在肠腔中出现等原因，故排泄到粪中去的细菌可以是间歇的和低密度的，所以有时必须重复分离并采取大量样品在增菌肉汤中培养。此外，这种常规方法为确诊而进行的细菌学鉴定需要几人才能报告结果，因此该方法不够简便、准确和快速。

传统的沙门氏菌检测方法的改进内容主要集中在选择性培养基的选择上。如由于沙门氏菌具有可特异性地分解丙烯乙二醇产酸，使中性红指示剂变红的生化特征，在分离培养基中加入丙烯乙二醇、

５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ呋喃

半乳糖，可实现对沙门氏菌的分离与鉴定工作同步进行，使

沙门氏菌检测所需时间从常规方法的４～６ｄ缩短至２ｄ；采用

Ｓａｌｍｏｓｙｓｔ培养基进行增菌后，

在Ｒａｍｂａｃｈ培养基上进行分离培养，可实现对沙门氏菌的快速检测，大大减少了检测中所需培养基种类，同时培养过程全部在３７℃下进行，操作简便。

二应用免疫酶标技术

目前己有应用ＥＬＩＳＡ对猪沙门氏菌抗体进行检测的报道。

张艳红通过试验确定了快速检测肠炎沙门氏菌的竞争ＥＬＩＳＡ方法（Ｃ－ＥＬＩＳＡ）。目前正在研制肠炎沙门氏菌特异性单克隆抗体Ｈｇｍ，两株单抗联合使用将会更准确地检测肠炎沙门氏菌。杨爱萍的试验结果表明单抗直接ＥＬＩＳＡ法灵敏度高，特异性强，可避免人为因素造成的假阴性，且能在短时间内快速筛去大量的阴性样品。检测时间比传统方法大为缩短，为加快产品流通提供了方便与可能。黄玲，孟冬丽等所作的自动酶标免疫测试仪（ｍｉｎｉ－

ＶＩＤＡＳ），检测的特点是只要沙

门氏菌存在于增菌培养基，不需纯培养，即可检出，只需增菌—上机后４９小时即检测出结果。具有省时、方便、灵敏、假阳性较少等特点，目前在国际、国内食品致病菌检测中逐渐走向成熟。殷月兰，潘志明等建立了利用竞争ＥＬＩＳＡ检测猪霍乱沙门氏菌抗体的方法，其具有单克隆抗体的高度特异性和

ＥＬＩＳＡ试验的高度敏感性。此

外，单抗竞争ＥＬＩＳＡ结果稳定性好，可以标准化和自动化，且可用肉眼判断。因此，单抗竞争

ＥＬＩＳＡ在实际检疫中具有推广

应用的价值。

目前建立和使用的多是间接ＥＬＩＳＡ，该方法只能在检测某一血清型沙门氏菌抗体时较为有效。若同时检测多种血清型沙门氏菌感染的抗体时则无能为力。

三ＰＣＲ技术

采用ＰＣＲ技术，国外有关这方而的报道也比较多。该方法比较灵敏和特异。但高费用的ＰＣＲ试验以及较高要求的试验技术限制了该方法在实际中的应用。

ＰＣＲ技术原理为提高ＤＮＡ

探针的敏感性，可先将靶ＤＮＡ序列扩增，增加ＤＮＡ数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。

近年来，ＰＣＲ及其相关技术得到了较大的发展，产生了多种新的ＰＣＲ方法。如反相ＰＣＲ（ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ）、反转录（ＲＴ－ＰＣＲ）、

长距离ＰＣＲ（ｌｏｎｇＰＣＲ）、随机扩增多态性ＤＮＡ技术（ＲＡＰＤ）等。另外将ＰＣＲ技术与微孔板检测技术、ＥＬＩＳＡ技术、探针杂交技术等有机结合起来，国内外都有不少报道。马立人等将ＰＣＲ与核酸探针技术相结合，己制成生物芯片检测沙门氏菌。ＰＣＲ敏感性试验显示，该体系能检出１４ｐｇ以上的沙门氏菌ＤＮＡ；当沙门氏菌和大肠

杆菌按不同比例混合后，直接

ＥＬＩＳＡ方法和ＰＣＲ方法的检测比

较试验结果显示，在沙门氏菌∶大肠杆菌为１∶１００时，用ＥＬＩＳＡ法和ＰＣＲ法均能检测出阳性样品，在沙门氏菌∶大肠杆菌为１∶１０００时，用ＥＬＩＳＡ法检测为阴性，而用ＰＣＲ法则能检测出。

可见，ＰＣＲ法较ＥＬＩＳＡ法的敏感性高、特异性强、快速、准确，结果分析简单，对待检样品要求不高，检测时间更短，只需３～４ｈ，但费用高、操作复杂、操作中的残留污染易导致假阴性和假阳性，而且需要专用仪器设备，对基层检验人员来说可操作性较差。

四核酸探针的应用

１

核酸探针

将已知核苷酸序列ＤＮＡ片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检ＤＮＡ样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的ＤＮＡ区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中ＤＮＡ的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链ＤＮＡ分子称为核

酸探针或基因探针。

２核酸探针的类型

根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分成ＤＮＡ探针或ＲＮＡ探针，一般大多选用ＤＮＡ探针；根据选用基因的不同分成两种，一种探针能同微生物中全部ＤＮＡ分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组ＤＮＡ发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。

３

探针检测技术中存在

的问题

检测一种菌就需要制备一种探针，目前尚未建立所有致病菌的探针，尽管检测速度快，但要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养，任何一种方法不可能有１００％的特异性和敏感性，所以必须考虑假阳性和假阴性的问题。

研究检测沙门氏菌的探针难度大，因为沙门氏菌拥有

２０００多个血清型，Ｆｉｌｌａｌ等人从

染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针，能识别３５０株不同的沙门氏菌。由于该方法最小检出量只有１个细菌／

２５ｇ样品，所以需要增菌培养。

五沙门氏菌的其它检

测方法

ＩＳＯ－ＧＲＩＤ检测系统是一

种基于疏水性网膜（ＨＧＭＦ）的过滤系统。该系统通过使用这种含有１６００个小方格的滤膜，来对微生物进行检测或计数。

首先，稀释的样品通过

５ｕｍ的不锈钢预过滤器过滤，

过滤掉可能引起微生物分析误差的样品残渣颗粒。然后，样品通过疏水的滤膜过滤。再将滤膜放在特异性的琼脂培养板上培养，以检测目标微生物。培养完成后，在膜上检测目标微生物，并记录阳性区域的数量。滤膜不会染上琼脂培养基的颜色，从而很容易地区别微生物，并进行鉴别和记数。此方法快速简便，重复性好，而且，除沙门氏菌外，还适用于大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、酵母、霉菌、大肠菌群及大肠杆菌的检测和计数。

本文仅对沙门氏菌的检测方法作了简单的综合性的概述，至于更优化、

更合理的沙门氏菌的检测程序还在进一步的研究之中。

□

为提高产蛋鸡的生产效益，应及时淘汰一些不理想鸡，这样既节省了饲料及其他方面的消耗，又能使鸡群整齐一致，提高其效益。但是目前的养鸡场，特别是广大农村的养鸡户，往往忽视了这一问题，造成不必要的浪费和减效。蛋鸡的淘汰要做到科学合理，应从如下几方面着手。

１在２０周龄前，除体型外貌应符合本品种的特征外，体质发育要良好。对鸡群中的瞎眼、歪嘴、跛行、消瘦、伤残、扭翅、秃尾、垂尾等的鸡应予以淘汰。

２在同一鸡群中，个体的生产性能是有差异的，当开产持续一段时间以后，这种差异就更加明显。应将那些产蛋性能较低甚至不产蛋的鸡挑

出来淘汰，约在２５０日龄时进行。一般来说，羽毛较完整、富有光泽，脚、喙角质层颜色深黄、富有光泽，活动异常灵活、快捷，鸡冠红润，外观漂亮的鸡往往都是低产鸡，甚至不产蛋，空耗料，应予以淘汰。

３夜间或早晨去鸡舍观

察粪便。正常产蛋鸡的粪便，多松软而湿润；而不产蛋的鸡，由于采食少，消化慢，消化道萎缩，其粪便呈干硬的条状，应及时予以淘汰。

４２８０日龄以后的鸡群，

应随时注意观察，这时的鸡群已产蛋５个月以上。有的鸡出现冠苍白、变薄、萎缩，这样的鸡已停产。由于长期持续产蛋，色素已退变，各部位（尤其是腿、喙）黄色素逐渐消失而呈白色，产蛋越多，退色越严

重。这时若有的鸡腿、喙颜色由白色变为黄色发亮，也说明是停产鸡（约停产３周的鸡，其喙、腿变黄色），应予以淘汰。

５大腹鸡。２８０日龄以后

的鸡群往往出现像企鹅样行走的鸡。触摸时可感到腹大发硬（卵黄性腹膜炎）或者腹大柔软如水（输卵管囊肿），这些鸡已不产蛋，应予淘汰。

６换羽。产蛋鸡在完成

一个产蛋期后，每年秋季换一次羽。低产鸡早在夏末秋初就开始换羽，且持续时间长，停产时间也长，故应予淘汰。

７产大蛋的鸡。２８０日龄

以后的蛋鸡群，往往有的鸡产的蛋特别大（像鸭蛋一样大）。这些鸡往往３天才产１枚蛋，蛋料比核算，已经赔本无利，应予以淘汰。

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沙

门氏菌的检测方法

■

阚

秋霞马增晖（山西农业大学，山西太谷

０３０８０１

）

淘汰不理想蛋鸡技术要点

■王庆泽（河北省唐山市丰润区农业畜牧水产局，唐山

０６４０００）

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