机能实验家兔肠缺血再灌注损伤教学教材
兔急性肠道缺血再灌注损伤模型的建立
兔急性肠道缺血再灌注损伤模型的建立【摘要】目的建立小肠急性缺血再灌注损伤模型，确定合适的肠系膜上动脉阻断时间。
方法将70只新西兰兔按不同的肠系膜缺血时间（0、15、30、45、60 min）分为A、B、C、D、E共5组，每组14只。
每组取8只于恢复血供2 h后留取兔下腔静脉血标本及肠组织，检测血清中丙二醛（MDA）含量的变化，光镜下观察小肠组织形态学变化并对小肠黏膜损伤程度进行评分。
另6只兔用于术后24、48、72 h 生存率的观察。
结果 A、B、C组的术后生存率均>83.3%。
C、D、E 组的MDA含量及肠黏膜损伤评分与A组比较，差异均有显著性（F=12.13、280.24,P<0.01）。
结论肠系膜缺血30 min再灌注2 h 是建立兔小肠急性缺血再灌注损伤的合适时间。
【关键词】肠；缺血；再灌注损伤；模型,动物［ABSTRACT］Objective To create a model of acute intestinal ischemia reperfusion injury in rabbits so as to determine suitable blocking duration of superior mesenteric arteries (SMA). Methods Seventy rabbits were divided into five groups as groups A, B, C, D, and E, based on the different blocking durations of SMA for 0, 15, 30, 45 and 60 minutes, respectively, with 14 rabbits in each group. Eight of the rabbits in each group were detected for serum levels of MDA 2 h after recovery of blood supply, the changes of histomorphology of small intestine observed light microscopically. The other sixrabbbits in each group were used to observe the 24 h, 48 h and 72 h survival rates after the blockage of SMA. Results The survival rates were over 83.3% in groups A, B and C. Serum levels of MDA and score of injury of intestinal mucosa were significantly higher in groups C, D and E than that in group A (F=12.13,280.24；P<0.01). Conclusion The suitable duration for creating a model of acute SMA ischemia reperfusion injury in small bowel is ischemia for 30 minutes and reperfusion for 2 hours.［KEY WORDS］ intestines; ischemia; reperfusion injury; model, animal缺血再灌注损伤(IRI)是指组织缺血一段时间，当血流重新恢复后，细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血时进一步加重，器官功能进一步恶化的临床综合征[1]。
家兔肠缺血再灌注损伤ppt课件
端，剪口部位尽量靠近远心
端，成45度角朝向近心端 剪一小口，约为管径的
1/3-2/3，插管方向朝向近
心端，插入2-4cm
【插管的注意事项】
插管内事先应加入少量肝素以防凝血；排净气
泡，记录前应关闭三通管
插管易滑脱，应双线固定，结扎牢靠 勿使插管尖端与血管壁形成角度，避免刺破血
【实验动物】
家兔（性别、体重）
【实验设计原理】
通过肠系膜上动脉结扎，即SMAO(Superior Mesentery Artery Occlusion)来阻断部分 肠的血液供应一段时间后再恢复血流灌注， 以复制肠缺血/再灌注损伤的动物模型，探
讨缺血/再灌注损伤的发生机制
【实验分组】
Байду номын сангаас Ⅰ组：持续缺血组 结扎肠系膜上动脉
（2）再灌注时遵循低压、低温、低钙的原则
（3）清除活性氧
（4） Ca2+拮抗剂的使用
（5） 减少白细胞的激活和炎性介质的释放 （6）补充能量及促进能量生成 （7）启动细胞内源性保护机制
【实验报告要点】
1、实验目的 2、实验动物 3、简单的实验步骤 4、列表记录所有组的实验指标 5、实验讨论 6、实验结论
① ② ③
时间
Ⅰ组：结扎→BP↑→BP↓趋于平稳（相似于结 扎前），肠壁粉红→暗红（淤血）肿胀（水 肿），无出血点 Ⅱ组：结扎→ BP↑→BP↓趋于平稳（机体自身 调节）→再灌→BP↓，肠壁暗红、水肿、出血 点，BP低于正常>1/2时→休克
※ Ⅰ、Ⅱ组比较说明：缺血损伤与I/R是不同的 损伤过程，后者损伤更严重
【结果不明显可能存在的问题】
（1）实验过程中是否发生了大血？ （2）缺血是否完全？ （3）再灌注是否通畅？ （4）记录结果时基线是否改变？
家兔肠缺血再灌注实验
2010 李娜
•实验目的 •实验动物： 家兔2.5 Kg左右 •实验药品： 25% 乌拉坦 2ml/Kg… •实验方法：
1. 全身麻醉后，固定。 2. 颈部手术：① 气管切开插管 （3-4软骨环） 3.腹部手术 ： ① 膀胱颈部结扎，膀胱荷包缝合。 ② 分离肠系膜上动脉。 4. 颈部手术： 分离左侧颈总动脉，动脉插管，接测压装置记录血压 （充分肝素化 充分肝素化）并且做耳缘静脉穿刺，ivgtt 0.3%肝素生理盐水。 充分肝素化 5. 记录生理指征： 心电图，呼吸曲线，肛温等。 6. 动脉夹夹闭肠系膜上动脉，观察并记录各项生理指标的变化。 7. 分离腹主动脉，用肝素化的注射器抽取动脉血0.3 ml，立即针头插入橡皮塞并做血 气分析。 8. 将实验结果及数据整理、制表。 9.写出实验报告，一周后上交 一周后上交。 一周后上交
（一）生理指标的观测 1. 家兔体重： ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱg 2. 生理指标的变化
生理指标 皮肤黏膜 颜色
时间（分钟）
肠袢形态 学改变
呼吸
血压
心率
肛温
尿量
0 10 20 30 40
打开动脉夹
20
家兔正常血气参考值
探究丹参对家兔肠系膜上动脉缺血再灌注肾损伤的影响
探究丹参对家兔肠系膜上动脉缺血再灌注肾损伤的影响摘要：目的：初步探究丹参处理对家兔肠系膜上动脉缺血再灌注所引起的肾损伤的作用。
方法：选用健康家兔24只，随机分为3组：肠系膜上动脉缺血前注射生理盐水的对照组（Ａ组）、缺血前注射丹参注射液的实验组（B组）、再灌注前注射丹参注射液的实验组（C组）。
常规动物实验操作找到肠系膜上动脉，夹闭家兔肠系膜上动脉30min造成缺血，再灌注30min。
观察尿量，收集不同时期尿肌酐、血肌酐、丙二醛（MDA）并测定其含量。
结果：家兔肠系膜上动脉缺血再灌注后尿量减少，A组减少最显著，其次是B组，C组减少较轻。
缺血再灌注后血肌酐、血清中丙二醛浓度增加，尿肌酐浓度下降，其中A组变化最明显，其次是Ｂ组，C组变化不明显。
结论：丹参能减轻家兔肠系膜上动脉缺血再灌注所引起的肾损伤，对肾损伤有保护作用。
关键词：肠系膜上动脉缺血再灌注丹参肾损伤肠缺血再灌注（ＩＩＲ）损伤是休克、严重创伤及复苏过程中常见的病理生理过程，普遍存在肠根阻、肠扭转、大手术、烧伤等。
研究表明，小肠缺血再灌注后除对小肠组织本身造成损害外，还会通过全是炎症反应对其他器官造成损伤。
目前认为，缺血再灌注损伤产生的主要机制与活性氧的损伤作用、钙超载的作用、白细胞损伤作用、补体级联的损伤作用有关。
研究表明，丹参具有扩张外周血管、抗血栓形成、改善微循环等作用。
本实验采用家兔肠系膜上动脉缺血再灌注模型造成肠缺血，探讨丹参对家兔肠系膜上动脉缺血再灌注所致的肾损伤的保护作用和影响及其可能的机制。
1.材料与方法1.1材料：1.1.1实验动物：健康家兔２４只，体重２—３㎏，清洁级，由南方医科大学实验动物中心提供。
1.1.2主要仪器：医用计算机记录系统（PcLab）及计算机、家兔手术台、哺乳动物手术器械一套、动脉插管、静脉插管、输尿管插管、压力换能器、离心机、分光光度计，恒温水浴箱、带刻度的试管及试管夹、试管和试管架、EP管、微量加样枪带枪头、电子天平、黑色丝线、纱布等。
病理生理学缺血再灌注损伤(完整)ppt课件
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蛋白质 断裂
蛋白质-蛋 白质交联
二硫交联
-S-S-
脂质-蛋白 质交联
OH
OH
HO
HO
CH3-S-
O
氨基酸 氧化
脂肪酸氧化
脂质-脂质交联
从氧化的脂肪 酸释出的
丙二醛MDA
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• 1967年，Bulkley和Hutchins发现冠脉 搭桥血管再通后的病人发生心肌细胞反 常性坏死
• 1968年，Ames率先报道脑缺血-再灌注
损伤
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以后陆续有其它器官缺血-再灌注损伤报道： • 1972年,Flore研究肾缺血-再灌注损伤
• 1978年,Modry报道了肺再灌注综合征
3.核酸及染色体破坏 80%由OH•所致
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第三节 缺血－再灌注损伤的发生机制
自由基的作用
钙超载
白细胞的作用
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结合于质膜 糖被的Ca2+
VOC
ROC
Ca2+
[Ca2+]e：10-3M
Ca2+ IP3受体通道
Ca2+泵
线粒体
肌浆网
[Ca2+]i：10-7M
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pH反常(pH paradox):再灌注时 迅速纠正缺血组织的酸中毒， 反而加重细胞损伤，称为pH反常。
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氧反常(oxygen paradox) 低氧灌注/缺氧培养 复氧 损伤加重
肾脏缺血后处理对兔急性肠道缺血再灌注损伤的保护作用
肾脏缺血后处理对兔急性肠道缺血再灌注损伤的保护作用目的探讨肾脏缺血后处理对兔急性肠道缺血再灌注损伤的保护作用及其可能的机制。
方法健康新西兰大白兔30只,随机分为3组(每组10只):对照组(Con)、肠道缺血后处理(IIP)、肾脏缺血后处理(RIP)。
再灌注结束后测定血浆中丙二醛(MDA)含量;实验结束后光镜下观察肠道组织形态学变化以及测定肠道组织髓过氧化物酶(MPO)活性。
结果IIP和RIP组再灌注2 h后MDA的含量明显的低于Con组(P＜0.01); SIP和RIP组再灌注2 h后组织MPO的活性明显的低于Con组(P＜0.01); SIP和RIP组再灌注2 h后光镜下观察肠道组织形态学变化证实肠道损伤程度的明显的轻于Con组(P＜0.01)。
结论肠道缺血再灌注前肾脏短暂缺血再灌注对肠道缺血再灌注损伤具有显著保护作用。
这种远离器官缺血后处理对肠道保护作用可能与减轻活性氧的损伤及抗氧化作用加强有关。
【Abstract】Objective In this study, we tested the hypothesis that remote postconditioning induced by a single 5-min episode of renal artery occlusion and reperfusion applied immediately before the onset ofsuperior mesenteric artery reperfusion protects the intestinal from reperfusion injury. Methods 30 healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups(n=10 in each group): control, intestinal ischemic postconditioning (IIP), and renal ischemic postconditioning (RIP). Tissue myeloperoxidase (MPO) activity and malondialdehyde (MDA) levels were determined and the morphology of some intestinal tissues was observed by microscopy at the end of the experiment. Results MDA levels and MPO activity was significantly reduced in IIP and RIP as compared to control (P＜0.01),also was confirmed by the score of intestinal mucosal injury. Conclusion Renal postconditioning provides potent intestinal mucosal injury. The potential mechanism of remote postconditioning might be associated decreasing the injury caused by oxygen free radicals and strengthening the action of antioxidation.【Key words】Remote postconditioning;Ischemia - reperfusion injury;Acute intestinal ischemia越来越多的肠系膜上动脉栓塞和血栓形成早期发现早期手术治疗肠缺血再灌注损伤越来越受到临床医生的重视。
机能实验学：肠缺血再灌注损伤
人血清（浆）7.1 ±1.2nM/ml 标准管参考吸光度：当标准品取样量为0.1ml时，则吸光度为0.060-0.070
四、注意事项
（一）耳沿静脉为后期输液通道，麻醉时尽量使 用一侧耳沿静脉；
（二）分离肠系膜上动脉时要细心，一定避免损 伤门静脉和下腔静脉；
再灌注至第30min时 放血处死动物
夹闭前 测量动脉血压、脉压、
心率。 动脉取血1.5ml 夹闭至第30min时 测量动脉血压、脉压、
心率
夹闭至第60min时 测量动脉血压、脉压、
心率 动脉取血1.5ml
三、实验技术路线
附MDA含量测定方法： ① 配制甲、乙液
甲液配制方法：1号试剂：2号试剂：3号试剂=0.1ml：3ml：1ml混合备用。 乙液配制方法：1号试剂：2号试剂：冰醋酸=0.1ml：3ml：1ml混合备用。 ② 测定方式：
（三）缺血再灌注损伤的防治原则 1、尽早恢复血流，尽量减少缺血时间； 2、注意再灌注时的低流、低压、低温； 3、改善缺血组织的代谢； 4、清除自由基。
三、实验技术路线
（一）实验动物 家兔 （二）观察指标
1、动脉血压、脉压、心率 2、血清丙二醛（MDA）含量
丙二醛（MDA）和超氧化物岐化酶（SOD）
MDA是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质。丙二醛可以 作为交联剂促进核酸、蛋白质及磷脂的交联，改变生物大分子的功能。通过检测 丙二醛的含量可以反映脂质过氧化的程度。
SOD可以岐化超氧离子生成H2O2，SOD作用的重要意义在于清除H2O2和 OH·的前身超氧离子，从而保护细胞不受毒性氧自由基的损伤。
后，组织的损伤程度较缺血时进一步加重， 器官功能进一步恶化的综合征。
新编第11章缺血再灌注损伤000002PPT课件
氧自由基损伤线粒体，加重能量代谢障碍。 2、缺乏合成ATP的前身物质： 在缺血组织内ATP的降解产物腺苷、肌酐、次黄嘌呤
等增多。恢复血流灌注后，血流将ATP的降解产物运走。 细胞物质氧化产生的能量缺乏与合成ATP的前身物质结合 ，所以恢复缺血组织的血液灌注后，短时间内缺血组织内 ATP的含量未能恢复正常。
根据此理论在灌注液中加入肌酐可促进能量代谢的恢
复。
缺血组织能量缺乏临床资料
心脏换瓣手术过程中不同时间心肌组织内ATP含量测定结果
心脏换瓣手术开始
心肌供血停止 心肌缺血
换瓣手术 进行40分钟
换瓣手术结束 心肌供血恢 心肌供血恢复 复后20分钟
心肌组织内 ATP含量最高
心肌组织内 ATP含量高于
恢复心肌供血 后20分钟
脂肪酸，即含有多个双键结构（存在共用电子对， 化学键的键力相对较弱）此处的电子（氢离子）往 往是自由基攻击（夺取）的目标。
细胞膜的双层脂质结构决定了细胞膜具有流动 性、液态性。细胞膜内相嵌有蛋白质、细胞膜表面 也有蛋白质，这些蛋白质具有受体、离子泵、离子 通道等多种功能。
动物实验进一步证实心肌内ATP含量的恢复在术后6 周。说明心肌经历一定时间缺血后即使恢复了心肌的血 液灌注，但是其能量代谢的恢复需要较长时间。
为什么在恢复心肌的血液灌注后，心肌的能量代谢 短时间内不能恢复呢？进一步的研究证实与下列因素有 关
1、线粒体损伤： 缺血组织内钙离子沉积、影响线粒体内生物氧化酶的
正常代谢过程中氧自由基的生成
O2 + 4H＋ ＝
氧自由基的生成
2H2O
O2 ＋e 超氧自由基 ＋e H2O2 +e 羟自由基 +e H2O H2O
缺血再灌注损伤ppt课件
ATP↓
3Na+
K+
NCaa+2↑+↑Ca2+ Na+
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(2)细胞内高H+间接激活Na+-Ca2+交换蛋白
质膜Na+/H+交换蛋白主要受细胞内[H+]的变化调节
[Na+]o ＞ [H+]o
[Na+]i
[H+]i
Na+
H+
缺血时：无氧代谢↑→产生H+增多
再灌时：组织间液H+迅速减少→细胞内外较高的
VEC激活表现为: 释放多种细胞粘附分子
粘附分子（adhesion molecule）
是指由细胞合成的、可促进细胞与 细胞之间、细胞与细胞外基质之间粘附的一大 类分子的总称，如整合素、选择素、细胞间粘 附分子、血管细胞粘附分子及血小板内皮细胞 粘附分子等。在维持细胞结构完整和细胞信号 转导中起重要作用。
ATP消耗↑、生成↓
2.激活膜磷脂酶
分解膜磷脂
细胞膜和细胞器膜的损伤
3.再灌注性心律失常 一过性内向离子流
Ca2+
迟后除极
3Na+ 27
4.促进氧自由基生成 激活XO
5.使肌原纤维过度收缩 (1)胞浆内高Ca2+ (2)再灌注期消除了H+对心肌收缩的抑制作用
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三、 微血管损伤和白细胞的作用
（一）缺血-再灌注时VEC与白细胞激活
3
氧反常：用低氧溶液灌注组织器官或在缺氧条件 下培养细胞一定时间后，再恢复正常氧供应， 组织及细胞的损伤不仅未能恢复，反而更趋严 重，这种现象称为氧反常oxygen paradox。
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【实验分组】
Ⅰ组：持续缺血组 夹闭肠系膜上动脉1h
Ⅱ组：再灌损伤组 夹闭肠系膜上动脉30min，再恢复血
流30min
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【实验方法与步骤】
• 1. 称重 • 2. 全麻（耳缘静脉注射25%乌拉坦
4ml/kg） • ★注意：从耳缘静脉的远心端开始注射， • 排尽气泡，速度不宜太快 • ★麻醉效果：角膜反射
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【典型结果】
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【结果不明显可能存在的问题】
• （1）实验过程中是否发生了大血？ • （2）缺血是否完全？ • （3）再灌注是否通畅？ • （4）记录结果时基线是否改变？ • （5）个体差异Leabharlann PPT学习交流20
【I/R的发生机制】
• （1）活性氧的作用 ） • （2）钙超载 ） • （3）白细胞的作用 ） • （4）高能磷酸化合物生成障碍 ）
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【如何防治I/R】
（1）尽早恢复血流灌流，缩短缺血时间 （2）再灌注时遵循低温、低压、低钙的原则 （3）清除活性氧 （4）Ca2+拮抗剂的使用 （5）减少白细胞的激活和炎性介质的释放 （6）补充能量及促进能量生成 （7）启动细胞内源性保护机制
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肠系膜上动脉示意图
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【注意事项】
• 1. 移动内脏时，动作要轻柔 • 2. 分离肠系膜上A时需小心细致，不要使
用锐利器械，以免损伤血管造成大出血 • 3. 肠系膜上A夹闭要彻底，缺血再灌注组
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基本消失，钳夹家兔
舌头无回收，四肢松软
3. 仰卧固定（背部交叉）、备皮 颈部正中（甲状软骨下缘→胸骨上切迹） 腹部正中（剑突下1.5cm起向下5cm） ★注意：平贴皮肤剪毛，勿拎起皮肤！
4.颈部正中切口行动脉插管
切口范围：颈部正中，甲状软骨下缘→胸骨 上切迹，长约5cm
分离左侧颈总动脉：胸 骨舌骨肌与胸锁乳突肌之 间深面的颈动脉鞘内，与
※ Ⅰ、Ⅱ组比较说明：缺血损伤与 是不同的 损伤过 程， 损伤过程，后者损伤更严重
【典型结果】
【结果不明显可能存在的问题】
（1）实验过程中是否发生了大血？ （2）缺血是否完全？ （3）再灌注是否通畅？ （4）记录结果时基线是否改变？ （5）个体差异
【I/R的发生机制】
（1）活性氧的作用 ） （2）钙超载 ） （3）白细胞的作用 ） （4）高能磷酸化合物生成障碍 ）
【如何防治I/R】
（1）尽早恢复血流灌流，缩短缺血时间 （2）再灌注时遵循低温、低压、低钙的原则 （3）清除活性氧 （4）Ca2+拮抗剂的使用 （5）减少白细胞的激活和炎性介质的释放 （6）补充能量及促进能量生成 （7）启动细胞内源性保护机制
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他血管（缺血再灌注夹闭时注意垫橡皮管）
7.记录一段正常血压曲线
8.复制肠缺血-再灌注模型，轻轻提起肠系膜上动脉的穿 线，用动脉夹夹闭，同时观察各项生理指标变化。
9.分组进行实验并记录各项指标。（Ⅰ组：夹闭肠系膜 上动脉1h Ⅱ组：夹闭肠系膜上动脉30min，再恢复血流
30min）
肠系膜上动脉示意图
机能实验家兔肠缺血再灌注损伤
【实验动物】
家兔
【实验器材】
兔 手 术 台 、 BL-420生物信息采集系统、Y型气管插管、 动脉夹、动脉插管、静脉插管、注射器、纱布、棉线、 实验动物常用手术器械一套、橡皮管、三通管、1%肝素、 25%乌拉坦、生理盐水
【实验设计原理】
通 过 肠 系 膜 上 动 脉 结 扎 ， 即 SMAO(Superior Mesentery Artery Occlusion)来阻断部分肠的血液供应一段时 间后再恢复血流灌注，以复制肠缺血/再灌 注损伤的动物模型，探讨缺血/再灌注损伤 的发生机制
【注意事项】
1. 移动内脏时，动作要轻柔 2. 分离肠系膜上A时需小心细致，不要使用锐利
器械，以免损伤血管造成大出血 3. 肠系膜上A夹闭要彻底，缺血再灌注组结扎时
注意垫橡皮管，恢复血流灌流（复流）要完全
【结果分析】
① 峰表示：结扎肠系膜上A→ 血管床容量↓→ 有效循环血量相 对↑→BP↑ 压力感受器 (+) 减压 反射→BP↓
插管内事先应加入少量肝素以防凝血；排净气 泡，记录前应关闭三通管
插管易滑脱，应双线固定，结扎牢靠 勿使插管尖端与血管壁形成角度，避免刺破血
管
5.腹部正中切口：
腹正中线自剑突下1.5cm起向下做5cm切口
※6.寻找肠系膜上动脉：
பைடு நூலகம்
将家兔腹腔内脏左移，找到齐右肾门对侧垂直向腹主
动脉分出的肠系膜上动脉，穿双线备用，注意避免损伤其
气管平行，颜色鲜红、 较细、触之有搏动感， 长约2-3cm，穿线备用
注意：（1）钝性分离 （2）辨清颈A鞘内的血管神经
血管插管
先结扎远心端，后夹闭近心 端，剪口部位尽量靠近远心 端，成45度角朝向近心端 剪一小口，约为管径的 1/3-1/2，插管方向朝向近 心端，插入1-1.5cm
【插管的注意事项】
② 峰表示：松开肠系膜上A→ 血管床容量↑→有效循环血量相 对 →BP↓升压反射（再灌注损 伤还未来得及发生）有时②峰 不出现，BP↓直到死亡
③ 血压持续下降，有再灌注损 伤
Ⅰ组：结扎→BP↑→ BP↓趋于平稳（相似于结 扎前）， 肠壁粉红→暗红（淤血）肿胀（水肿），无出血点
Ⅱ组：结扎→ BP↑→BP↓趋于平稳（机体自身调节） →再灌→BP↓，肠壁暗红、水肿、出血点BP低于正常 >1/2时→休克
【实验分组】
Ⅰ组：持续缺血组 夹闭肠系膜上动脉1h
Ⅱ组：再灌损伤组 夹闭肠系膜上动脉30min，再恢复血
流30min
【实验方法与步骤】
1. 称重
2. 全 麻 （ 耳 缘 静 脉 注 射 25% 乌 拉 坦
4ml/kg）
★注意：从耳缘静脉的远心端开始注射，
排尽气泡，速度不宜太快
★麻醉效果：角膜反射