高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
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高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
《高效液相色谱培训》课件
讲解色谱柱的分类、特点以及如何选择合适的色谱柱。
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
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# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
高效液相色谱法指导培训讲义
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法培训课件
高效液相色谱法培训课件
欢迎参加本次高效液相色谱法（HPLC）培训。在这个课程中，我们将会探究 这项重要的分析技术，介绍其原理、仪器和设备，体相和一列分离材料（通常是一种固定的液相柱）分 离并分析混合物。我们将介绍是什么让HPLC区别于其他分析方法，深入探讨 液相柱，以及如何选择适当的流动相。
环境监测
HPLC在环境监测中亦有 广泛的应用，我们将探究 HPLC在环境监测领域中 的各种应用。
食品安全检测
HPLC在食品安全检测领 域中也被广泛使用，例如 检测食品中的添加剂、有 害物质以及质量控制。
样品准备与处理
我们将讨论如何选择适当的样品处理方法，如何处理样品，以及样品前处理 的步骤。我们还将探讨如何选择适量的标准品和如何使用标准曲线。
常见问题与解决方法
色谱峰形不对称的原因与调整 方法
我们将探究造成色谱峰形不对称的原因，以及 如何调整色谱峰。
杂质峰的出现与解决方法
我们将探究杂质峰出现的原因，以及如何从样 品中去除杂质峰。
HPLC的仪器和设备
HPLC可能需要用到多种仪器，例如梯度系统和检测器。我们将介绍这些仪器 的功能以及如何在实验室中使用它们。我们还会详细介绍如何使用手动和自 动进样器。
操作流程
样品准备
样品制备可能是HPLC分析过程中最重要的部分 之一。我们将讨论如何正确样品准备以及如何 处理样品中的杂质。
色谱柱和流动相的选择
颜色、粘度和PH值等都会影响流动相的选择。 我们将详细讨论如何选择适当的流动相以及如 何选择适当的色谱柱。
手动和自动化进样的步骤
手动和自动化进样器的使用会影响实验的结果， 这个章节将讨论如何正确使用手动和自动化进
梯度洗脱的方法
我们将讨论什么是梯度洗脱，如何正确选择梯 度的组成。
欢迎参加本次高效液相色谱法（HPLC）培训。在这个课程中，我们将会探究 这项重要的分析技术，介绍其原理、仪器和设备，体相和一列分离材料（通常是一种固定的液相柱）分 离并分析混合物。我们将介绍是什么让HPLC区别于其他分析方法，深入探讨 液相柱，以及如何选择适当的流动相。
环境监测
HPLC在环境监测中亦有 广泛的应用，我们将探究 HPLC在环境监测领域中 的各种应用。
食品安全检测
HPLC在食品安全检测领 域中也被广泛使用，例如 检测食品中的添加剂、有 害物质以及质量控制。
样品准备与处理
我们将讨论如何选择适当的样品处理方法，如何处理样品，以及样品前处理 的步骤。我们还将探讨如何选择适量的标准品和如何使用标准曲线。
常见问题与解决方法
色谱峰形不对称的原因与调整 方法
我们将探究造成色谱峰形不对称的原因，以及 如何调整色谱峰。
杂质峰的出现与解决方法
我们将探究杂质峰出现的原因，以及如何从样 品中去除杂质峰。
HPLC的仪器和设备
HPLC可能需要用到多种仪器，例如梯度系统和检测器。我们将介绍这些仪器 的功能以及如何在实验室中使用它们。我们还会详细介绍如何使用手动和自 动进样器。
操作流程
样品准备
样品制备可能是HPLC分析过程中最重要的部分 之一。我们将讨论如何正确样品准备以及如何 处理样品中的杂质。
色谱柱和流动相的选择
颜色、粘度和PH值等都会影响流动相的选择。 我们将详细讨论如何选择适当的流动相以及如 何选择适当的色谱柱。
手动和自动化进样的步骤
手动和自动化进样器的使用会影响实验的结果， 这个章节将讨论如何正确使用手动和自动化进
梯度洗脱的方法
我们将讨论什么是梯度洗脱，如何正确选择梯 度的组成。
高效液相色谱培训课件
培训课件年月目录……..液相色谱的理论部分……..液相色谱的操作部分（三聚氰胺的检测）……..色谱柱的安装…….. 三聚氰胺检测卡的使用…….. 水解蛋白的检测.…….灰分的测定…….马弗炉的使用……..食品中蛋白质的测定……仪器回收率的测定……的使用……..塑化剂的检测一、高效液相色谱的理论部分一、色谱定义1、色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术。
2、流动相：携带样品流过整个系统的流体。
3、固定相：静止不动的一相，色谱柱。
二、色谱的分类1、高效液相色谱。
、气相色谱。
、薄层色谱。
、毛细管电泳。
三、色谱优点1、同时分析。
、分离性能好。
、灵敏度高（—）。
、进样量小（—μ）。
四、色谱要求1、水：专门的纯水机或超纯水机，理想的用水应为18.2MΩ超纯水，并通过μ的滤膜，除去热源、有机物、无机离子等。
不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水。
2、有机溶剂：色谱纯，用前需要有机膜过滤，超声。
3、缓冲盐：水系膜过滤，超声，冷藏，易长菌。
使用前后必需要用：的甲醇水过渡，不能直接使用纯有机溶剂。
否则会造成腐蚀、磨损、阻塞等现象。
使用前后，需要用纯水冲洗泵头清洗管路，易受细菌和霉菌的影响。
4、脱气（超声）：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。
泵中气泡使液流波动，改变保留时间各峰面积；柱中气泡使流动相绕流，峰变形；检测器中的气泡产生基线波动。
五、高压梯度洗脱：用两台高压输液泵将两种溶剂输入。
避免分析时间长，分离度差，在最短时间内获得最佳的分离。
六、柱温箱，我们设定的柱温为40℃，这样是为了分析结果重现性好，提高柱效，降低柱压，保证检测稳定性。
七、分析柱的维护1、在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下（）冲洗，长时间未用的分析柱也要同样处理。
2、定期作用强溶剂冲洗柱子。
3、我们使用的流动相主要是缓冲盐，要先用：的甲醇水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。
4、净化样品。
5、分离条件。
6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干涸。
高效液相色谱分析 培训课件
（１）高效液相色谱分析的流程由泵将贮液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物则由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器做梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（２）高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有３个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分Ｃ在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分Ｂ的分配系数介于Ａ和Ｃ之间，第二个流出色谱柱。
（２）高效液相色谱的分离过程若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离的目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效应。
（３）高效液相色谱的分类①液－固色谱法：液－固色谱法（液－固吸附色谱法）的固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的，液－固色谱法常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同异构体，但不宜用于分离同系物。
安捷伦1260高效液相色谱培训课件
C、一般情况下色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱 可以反冲时，才可以反冲除去柱内杂质，否则反冲会 迅速降低柱效。
D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固 定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入 分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基 质被溶解。
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。
•9 •安捷伦1260高效液相色谱培训
E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一 个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以 经常更换。 F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接
•4 •安捷伦1260高效液相色谱培训
2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质 微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先 除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应 保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如 果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至 由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将 损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗 干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空 泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会 使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的 稳定。
D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固 定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入 分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基 质被溶解。
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。
•9 •安捷伦1260高效液相色谱培训
E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一 个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以 经常更换。 F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接
•4 •安捷伦1260高效液相色谱培训
2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质 微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先 除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应 保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如 果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至 由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将 损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗 干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空 泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会 使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的 稳定。
高效液相色谱仪基础培训课程
Chromatography 1972 Stein 和 Moore 获诺贝尔化学奖
Majors 和 Kirkland 发明 microparticulate packed columns 1977 Microprocessor controlled pumps 1978 Micron packing 1983 Microbore column
作用
参与分离作用
分析样品无分子量限制
分析样品分子量一般小于 500 amu
液相色谱的分类
❖ 反相色谱是目前使用最普遍的一种色谱方法
液相色谱分离模式 流动相 固定相
分离机制
吸附法
非极性溶剂 极性填料
吸附
反相色谱
分配法
正相色谱
尺寸排阻 离子交换
极性溶剂
非极性溶剂 非交互作用溶
剂 离子对试剂
非极性 极性固相
分配系数K
❖ 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关， 也与温度、压力有关。
❖ 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样 品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的 性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件， 在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况 下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰； 而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前 延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内 浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
应用领域 药物分析 生物化学
食品、饮料 化学工业 环境分析 滥用药物
临床实验
样
品
抗生素, 镇静剂, 类固醇, 止痛?
市场比例 30
氨基酸, 蛋白, 糖类, 脂质类
10
人工合成甜味剂, 抗氧化剂, 黄曲霉素, 添 加剂
Majors 和 Kirkland 发明 microparticulate packed columns 1977 Microprocessor controlled pumps 1978 Micron packing 1983 Microbore column
作用
参与分离作用
分析样品无分子量限制
分析样品分子量一般小于 500 amu
液相色谱的分类
❖ 反相色谱是目前使用最普遍的一种色谱方法
液相色谱分离模式 流动相 固定相
分离机制
吸附法
非极性溶剂 极性填料
吸附
反相色谱
分配法
正相色谱
尺寸排阻 离子交换
极性溶剂
非极性溶剂 非交互作用溶
剂 离子对试剂
非极性 极性固相
分配系数K
❖ 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关， 也与温度、压力有关。
❖ 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样 品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的 性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件， 在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况 下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰； 而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前 延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内 浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
应用领域 药物分析 生物化学
食品、饮料 化学工业 环境分析 滥用药物
临床实验
样
品
抗生素, 镇静剂, 类固醇, 止痛?
市场比例 30
氨基酸, 蛋白, 糖类, 脂质类
10
人工合成甜味剂, 抗氧化剂, 黄曲霉素, 添 加剂
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注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积(V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
溶质的色谱保留行为主要是由该溶质 在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决 定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时 性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达 到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。
K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ・Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs
式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流 动相中的质量。
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出
所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。
不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
2.分离度（R）
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离
物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能 的关键指标。可以通过测定待测物质与已 知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分 与某一添加的指标性成分(内标物质或其他 难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品 用适当的方法降解,通过测定待测组分与某 一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价 与控制。
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
高效液相色谱法基本知识培训-化验员 入门培训
路漫漫其悠远
少壮不努力，老大徒悲伤
第一节 高效液相色谱 的定义及基本参数
定义
高效液相色谱法系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱， 对供试品进行分离测定的色谱方法。注入 的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组 分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实Байду номын сангаас：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
用于评价色谱峰的对 称性。为保证分离效 果和测量精度,应检查 待测峰的拖尾因子是 否符合各品种项下的 规定。
重复性
用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重 复性能。采用外标法时,通常取各品种项下 的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外, 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时,通常配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内 标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少 进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏 差应不大于2.0%。
基本参数
（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积(V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
溶质的色谱保留行为主要是由该溶质 在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决 定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时 性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达 到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。
K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ・Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs
式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流 动相中的质量。
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出
所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。
不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
2.分离度（R）
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离
物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能 的关键指标。可以通过测定待测物质与已 知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分 与某一添加的指标性成分(内标物质或其他 难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品 用适当的方法降解,通过测定待测组分与某 一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价 与控制。
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
高效液相色谱法基本知识培训-化验员 入门培训
路漫漫其悠远
少壮不努力，老大徒悲伤
第一节 高效液相色谱 的定义及基本参数
定义
高效液相色谱法系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱， 对供试品进行分离测定的色谱方法。注入 的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组 分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实Байду номын сангаас：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
用于评价色谱峰的对 称性。为保证分离效 果和测量精度,应检查 待测峰的拖尾因子是 否符合各品种项下的 规定。
重复性
用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重 复性能。采用外标法时,通常取各品种项下 的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外, 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时,通常配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内 标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少 进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏 差应不大于2.0%。
基本参数
（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。