索拉非尼对肝癌患者血清中肿瘤相关miRNAs的影响_成炳祥
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CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 9 March 2014 41
· 实验研究 ·
中国医药导报 2014 年 3 月第 11 卷第 9 期
的变化，提示 miRNA 对于肝癌的 发 生 和 发展中起着 非常重要的作用[8]。 本研究采用 miRNA 芯片技术检测 索拉菲尼治疗前后对肝癌患者血清中肿瘤相关 miRNA 表达谱改变情况，为进一步研究索拉 菲尼治疗肝 癌的机制提供理论依据。 1 资料与方法 1.1 一般资料
收 集 2011 年 10 月～2012 年 9 月 在 绍 兴 第 二 医 院及浙江大学医学院附属第一医院接受治疗的 6 例 肝癌患者的血清样本。所有患者均经 组 织 病 理 学 检 测 证 实 为 肝 细 胞 肝 癌 ，诊 断 均 符 合2001 年肝癌临床诊 断标准和临床分期。 所选病例应同时满足以下条件：不 适合手术治疗，体力状况 ECOG 评分≤2 分，Child-Pugh 评 分 A、B 级 ， 预 计 生 存 时 间 >12 周，血小板（PLT）≥ 60×109/L，血红蛋白（Hb）≥85 g/L，谷丙转氨酶 （ALT）和 谷草转氨酶（AST）≤正常值上限 3 倍以内。本组研究对 象中男 4 例，女 2 例，平均年龄（52.6±14.8）岁；肿瘤直 径 8.7～15.4 cm；病灶数 目 1～3 个 ，其 中 单 发 2 例 、多 发 4 例；甲胎蛋白（AFP）平均值（837.42±178.75）ng/mL。 1.2 主要试剂和仪器
基于芯片结果对 miR-122 进行验证。 采用 stem-loop 进 行 miRNA 逆 转 录 。 反 应 条 件 如 下 ：16℃，30 min； 42℃，40 min；85°C，5 min。 采用 Sybergreen Ⅰ方法进 行 Realtime PCR 反应 。 按以下程 序进行扩增 ：95℃， 10 min；40 个 PCR 循环（95℃，15 s；60℃，60 s），扩增反 应 结 束 后 继 续 从 72°C 缓 慢 加 热 到 99℃以 建 立 PCR 产物的熔解曲线（每 5 秒升高 1℃），实验重复 3 次，以 U6 snRNA 作 为 内 参 ，数 据 采 用 2-ΔΔCT 法 对 miR-122 的表达进行分析。 1.7 统计学方法
42 CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 9 March 2014
质量。 ②制备荧光标记探针：采用 miRCURYTM Array Power 标 记 试 剂 盒 ，用 标 记 酶 将 Hy3TM：荧 光 基 团 标 记 miRNA 制 备 荧 光 标 记 探 针 。 ③miБайду номын сангаасNA 芯 片 杂 交、图像扫描和数据分析：在标准条件下将制备好的 荧 光 标 记 探 针 和 miRCURYTM 芯 片 放 入 PhalanxTM 的 热收缩杂交袋进行杂交。 使用 GenePix 4000B 芯片扫 描仪对杂交好的芯片进行扫描并收集荧光强度信号， 图像生 成后使用 Genepix Pro 6.0 软件对原始 数据 进 行分析运算，并将实验结果转换成数字型数据保存。 芯 片 实 验 数 据 分 析 软 件 MeV4.0 对 数 据 进 行 聚 类 分 析 ，计 算 两 种 检 测 信 号 的 比 值 （log2）。 1.6 Real time RT-PCR 验证
和血管内皮生长因子受体（VEGFR）-1，2，3 等通路的 抑制调控，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖和阻断肿瘤新 生血管形成的双重抗肿瘤 作用 。 [2-3] 目前临 床研究证 实，索拉非尼的使用可以有效提高肝癌患者的生存时 间[4-5]。 miRNA 是近年来发现的一类广泛存在于人体中， 不编码蛋白质的短序列 RNA（20～25 nt），在细胞生长和 凋亡、干细胞分化、胚胎后期发育过程中发挥着重要 的调控作用 。 [6-7] 值得 关注的是 ，miRNAs 表达谱和表 达水平在肝癌肿瘤组织和患者血清中均出现较明显
[文献标识码] A
[文章编号] 1673-7210（2014）03（c）-0041-04
Altered expression levels of miRNAs in serum of patients with hepatocellular carcinoma in the treatment of Sorafenib
肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其进展迅速， 对放化疗不敏感，手术切除后易转移复发，因而在我 国恶性肿瘤的病死率中，肝癌占第 2 位[1]。 索拉菲尼是 一种新型的口服多激酶抑制剂，其通过对 Raf/丝裂原 活 性 蛋 白 激 酶 /细 胞 外 信 号 转 导 通 路 （Raf/MEK/ERK）
[基 金 项 目] 浙 江 省 卫 生 厅 一 般 研 究 计 划 项 目 （编 号 2013 KYB107）。 [作 者 简 介] 成 炳 祥 （1969.11-），男 ，浙 江 绍 兴 人 ，副 主 任 医 师；研究方向：肝胆胰外科。
中国医药导报 2014 年 3 月第 11 卷第 9 期
· 实验研究 ·
索拉非尼对肝癌患者血清中肿瘤相关 ｍｉＲＮＡｓ 的影响
成炳祥 1 方 煊 1 朱承良 1 秦运升 2 庄 莉 2 1.浙江省绍兴第二医院外科，浙江绍兴 312000；2.浙江大学医学院附属第一医院肝胆外科，浙江杭州 310003
① 总 RNA 和 miRNA 的 提 取 按 照 mirVanaTM miRNA Isolation Kit 和 mirVanaTM RNA Isolation Kit 说 明 书 步 骤 进 行 操 作 。 DU-730 紫 外 分 光 光 度 计 进 行 RNA 定量，1.5%甲醛变性琼脂 糖凝胶电 泳检测 RNA
索拉非尼（商品名：多吉美，拜耳公司；批号： H20060296）采用统一的给药方式，400 mg/次，2 次/d， 口服，服药前禁食 2 h。比较患者服药前和服药 1 个月 后各项指标。 1.4 血清样本的收集
所有患者服药前和服药 1 个月后空腹采集外周静 脉血 5 mL，室温下静置 60 min。 然后在 4℃，3000 r/min 条件下离心 15 min，取上清（血清）保存于-80°C 冰箱 待下一步实验。 1.5 miRNA 表达谱芯片检测
（RT-PCR）对筛选出的 miRNAs 进行验证。 结果 索拉非尼治疗前后肝癌患者血清 miRNA 表达谱出现明显改变，
16 个 miRNAs 在索拉非尼治疗后肝癌患者血清中表达明显升高，10 个 miRNAs 在索拉非尼治疗后肝癌患者血清
中表达明显降低。 治疗前肝癌患者血清 miR-122 相对表达值为（1.07±0.32），治疗 1 个月后的 miR-122 相对表达
值为（9.10±1.89），差异有统计学意义（P < 0.05），较治疗前表达水平显著上调 。 结论 索拉非尼治疗前后肝癌患
者血清中表达谱发生明显变化，索拉非尼对肝癌相关 miRNAs 的调控可能是其治疗肿瘤的重要机制之一。
[关键词] miRNA 芯片；索拉非尼；肝细胞癌；血清
[中图分类号] R575.2
CHENG Bingxiang1 FANG Xuan1 ZHU Chengliang1 QIN Yunsheng2 ZHUANG Li2 1.Department of Surgery, Shaoxing Second Hospital, Zhejiang Province, Shaoxing 312000, China; 2.Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Zhejiang Province, Hangzhou 310003, China [Abstract] Objective To investigate the differential expression of miRNAs in serum of patients with hepatocellular carcinoma (HCC) in the treatment of Sorafenib. Methods Blood samples in 6 patients with HCC in Shaoxing Second Hospital and the First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University from October 2011 to September 2012 were selected. The miRNA microarray was chosen to assess the level and composition of miRNAs in serum of patients with HCC in the treatment of Sorafenib. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to validate the data of miRNA microarray. Results There were significant changes in some miRNAs in serum of patients with HCC post Sorafenib treatment (10 miRNAs were more than 2-fold down-regulated and 16 miRNAs were more than 2-fold up-regulated). Relative expression values of miR-122 before the treatment was (1.07±0.32), the expression values of miR-122 1 month after the treatment was (9.10±1.89), the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion Sorafenib treatment can make significant changes in the spectra and levels of serum miRNAs in patients with HCC, the regulation of HCC related miRNAs by Sorafenib may be one important mechanism of treatment of cancer. [Key words] miRNA microarray; Sorafenib; Hepatocellular carcinoma; Serum
[摘要] 目的 探讨索拉非尼治疗前后对肝癌患者血清中肿瘤相关 miRNA 表 达 谱 改 变情 况 。 方 法 收 集 2011 年
10 月～2012 年 9 月在绍兴第二医院及浙江大学医学院附属第一医院接受治疗的 6 例肝癌患者的血清样本，采用
miRNA 表达谱芯片检测 HCC 患者经索拉 非 尼治 疗 前 后 血 清 中 差 异 表达 的 miRNAs，并 应 用 实 时 荧 光 定 量 PCR
mirVanaTMmiRNA Isolation Kit （Ambion 公 司 ， 美 国）；miScript Reverse Transcription Kit （Qiagen 公司， 德国）；SYBR Green I（10000×）和 Platinum R Taq DNA 聚 合 酶 （Invitrogen 公 司 ， 美 国 ）；MMLV 反 转 录 酶 和 RNA 酶抑制剂（epicentre 公司，美国）；miRNA 芯片由 丹麦 Exiqon 公司制作，上海康成生物工程有限公司代 理 ；DU-730 紫 外 分 光 光 度 计 和 PRISM 7900 实 时 荧 光 定 量 PCR 仪 （ABI 公 司 ，美 国 ）；miR-122 及 U6 引 物序列由阅微基因技术有限公司合成。 1.3 药物干预
· 实验研究 ·
中国医药导报 2014 年 3 月第 11 卷第 9 期
的变化，提示 miRNA 对于肝癌的 发 生 和 发展中起着 非常重要的作用[8]。 本研究采用 miRNA 芯片技术检测 索拉菲尼治疗前后对肝癌患者血清中肿瘤相关 miRNA 表达谱改变情况，为进一步研究索拉 菲尼治疗肝 癌的机制提供理论依据。 1 资料与方法 1.1 一般资料
收 集 2011 年 10 月～2012 年 9 月 在 绍 兴 第 二 医 院及浙江大学医学院附属第一医院接受治疗的 6 例 肝癌患者的血清样本。所有患者均经 组 织 病 理 学 检 测 证 实 为 肝 细 胞 肝 癌 ，诊 断 均 符 合2001 年肝癌临床诊 断标准和临床分期。 所选病例应同时满足以下条件：不 适合手术治疗，体力状况 ECOG 评分≤2 分，Child-Pugh 评 分 A、B 级 ， 预 计 生 存 时 间 >12 周，血小板（PLT）≥ 60×109/L，血红蛋白（Hb）≥85 g/L，谷丙转氨酶 （ALT）和 谷草转氨酶（AST）≤正常值上限 3 倍以内。本组研究对 象中男 4 例，女 2 例，平均年龄（52.6±14.8）岁；肿瘤直 径 8.7～15.4 cm；病灶数 目 1～3 个 ，其 中 单 发 2 例 、多 发 4 例；甲胎蛋白（AFP）平均值（837.42±178.75）ng/mL。 1.2 主要试剂和仪器
基于芯片结果对 miR-122 进行验证。 采用 stem-loop 进 行 miRNA 逆 转 录 。 反 应 条 件 如 下 ：16℃，30 min； 42℃，40 min；85°C，5 min。 采用 Sybergreen Ⅰ方法进 行 Realtime PCR 反应 。 按以下程 序进行扩增 ：95℃， 10 min；40 个 PCR 循环（95℃，15 s；60℃，60 s），扩增反 应 结 束 后 继 续 从 72°C 缓 慢 加 热 到 99℃以 建 立 PCR 产物的熔解曲线（每 5 秒升高 1℃），实验重复 3 次，以 U6 snRNA 作 为 内 参 ，数 据 采 用 2-ΔΔCT 法 对 miR-122 的表达进行分析。 1.7 统计学方法
42 CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 9 March 2014
质量。 ②制备荧光标记探针：采用 miRCURYTM Array Power 标 记 试 剂 盒 ，用 标 记 酶 将 Hy3TM：荧 光 基 团 标 记 miRNA 制 备 荧 光 标 记 探 针 。 ③miБайду номын сангаасNA 芯 片 杂 交、图像扫描和数据分析：在标准条件下将制备好的 荧 光 标 记 探 针 和 miRCURYTM 芯 片 放 入 PhalanxTM 的 热收缩杂交袋进行杂交。 使用 GenePix 4000B 芯片扫 描仪对杂交好的芯片进行扫描并收集荧光强度信号， 图像生 成后使用 Genepix Pro 6.0 软件对原始 数据 进 行分析运算，并将实验结果转换成数字型数据保存。 芯 片 实 验 数 据 分 析 软 件 MeV4.0 对 数 据 进 行 聚 类 分 析 ，计 算 两 种 检 测 信 号 的 比 值 （log2）。 1.6 Real time RT-PCR 验证
和血管内皮生长因子受体（VEGFR）-1，2，3 等通路的 抑制调控，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖和阻断肿瘤新 生血管形成的双重抗肿瘤 作用 。 [2-3] 目前临 床研究证 实，索拉非尼的使用可以有效提高肝癌患者的生存时 间[4-5]。 miRNA 是近年来发现的一类广泛存在于人体中， 不编码蛋白质的短序列 RNA（20～25 nt），在细胞生长和 凋亡、干细胞分化、胚胎后期发育过程中发挥着重要 的调控作用 。 [6-7] 值得 关注的是 ，miRNAs 表达谱和表 达水平在肝癌肿瘤组织和患者血清中均出现较明显
[文献标识码] A
[文章编号] 1673-7210（2014）03（c）-0041-04
Altered expression levels of miRNAs in serum of patients with hepatocellular carcinoma in the treatment of Sorafenib
肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其进展迅速， 对放化疗不敏感，手术切除后易转移复发，因而在我 国恶性肿瘤的病死率中，肝癌占第 2 位[1]。 索拉菲尼是 一种新型的口服多激酶抑制剂，其通过对 Raf/丝裂原 活 性 蛋 白 激 酶 /细 胞 外 信 号 转 导 通 路 （Raf/MEK/ERK）
[基 金 项 目] 浙 江 省 卫 生 厅 一 般 研 究 计 划 项 目 （编 号 2013 KYB107）。 [作 者 简 介] 成 炳 祥 （1969.11-），男 ，浙 江 绍 兴 人 ，副 主 任 医 师；研究方向：肝胆胰外科。
中国医药导报 2014 年 3 月第 11 卷第 9 期
· 实验研究 ·
索拉非尼对肝癌患者血清中肿瘤相关 ｍｉＲＮＡｓ 的影响
成炳祥 1 方 煊 1 朱承良 1 秦运升 2 庄 莉 2 1.浙江省绍兴第二医院外科，浙江绍兴 312000；2.浙江大学医学院附属第一医院肝胆外科，浙江杭州 310003
① 总 RNA 和 miRNA 的 提 取 按 照 mirVanaTM miRNA Isolation Kit 和 mirVanaTM RNA Isolation Kit 说 明 书 步 骤 进 行 操 作 。 DU-730 紫 外 分 光 光 度 计 进 行 RNA 定量，1.5%甲醛变性琼脂 糖凝胶电 泳检测 RNA
索拉非尼（商品名：多吉美，拜耳公司；批号： H20060296）采用统一的给药方式，400 mg/次，2 次/d， 口服，服药前禁食 2 h。比较患者服药前和服药 1 个月 后各项指标。 1.4 血清样本的收集
所有患者服药前和服药 1 个月后空腹采集外周静 脉血 5 mL，室温下静置 60 min。 然后在 4℃，3000 r/min 条件下离心 15 min，取上清（血清）保存于-80°C 冰箱 待下一步实验。 1.5 miRNA 表达谱芯片检测
（RT-PCR）对筛选出的 miRNAs 进行验证。 结果 索拉非尼治疗前后肝癌患者血清 miRNA 表达谱出现明显改变，
16 个 miRNAs 在索拉非尼治疗后肝癌患者血清中表达明显升高，10 个 miRNAs 在索拉非尼治疗后肝癌患者血清
中表达明显降低。 治疗前肝癌患者血清 miR-122 相对表达值为（1.07±0.32），治疗 1 个月后的 miR-122 相对表达
值为（9.10±1.89），差异有统计学意义（P < 0.05），较治疗前表达水平显著上调 。 结论 索拉非尼治疗前后肝癌患
者血清中表达谱发生明显变化，索拉非尼对肝癌相关 miRNAs 的调控可能是其治疗肿瘤的重要机制之一。
[关键词] miRNA 芯片；索拉非尼；肝细胞癌；血清
[中图分类号] R575.2
CHENG Bingxiang1 FANG Xuan1 ZHU Chengliang1 QIN Yunsheng2 ZHUANG Li2 1.Department of Surgery, Shaoxing Second Hospital, Zhejiang Province, Shaoxing 312000, China; 2.Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Zhejiang Province, Hangzhou 310003, China [Abstract] Objective To investigate the differential expression of miRNAs in serum of patients with hepatocellular carcinoma (HCC) in the treatment of Sorafenib. Methods Blood samples in 6 patients with HCC in Shaoxing Second Hospital and the First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University from October 2011 to September 2012 were selected. The miRNA microarray was chosen to assess the level and composition of miRNAs in serum of patients with HCC in the treatment of Sorafenib. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to validate the data of miRNA microarray. Results There were significant changes in some miRNAs in serum of patients with HCC post Sorafenib treatment (10 miRNAs were more than 2-fold down-regulated and 16 miRNAs were more than 2-fold up-regulated). Relative expression values of miR-122 before the treatment was (1.07±0.32), the expression values of miR-122 1 month after the treatment was (9.10±1.89), the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion Sorafenib treatment can make significant changes in the spectra and levels of serum miRNAs in patients with HCC, the regulation of HCC related miRNAs by Sorafenib may be one important mechanism of treatment of cancer. [Key words] miRNA microarray; Sorafenib; Hepatocellular carcinoma; Serum
[摘要] 目的 探讨索拉非尼治疗前后对肝癌患者血清中肿瘤相关 miRNA 表 达 谱 改 变情 况 。 方 法 收 集 2011 年
10 月～2012 年 9 月在绍兴第二医院及浙江大学医学院附属第一医院接受治疗的 6 例肝癌患者的血清样本，采用
miRNA 表达谱芯片检测 HCC 患者经索拉 非 尼治 疗 前 后 血 清 中 差 异 表达 的 miRNAs，并 应 用 实 时 荧 光 定 量 PCR
mirVanaTMmiRNA Isolation Kit （Ambion 公 司 ， 美 国）；miScript Reverse Transcription Kit （Qiagen 公司， 德国）；SYBR Green I（10000×）和 Platinum R Taq DNA 聚 合 酶 （Invitrogen 公 司 ， 美 国 ）；MMLV 反 转 录 酶 和 RNA 酶抑制剂（epicentre 公司，美国）；miRNA 芯片由 丹麦 Exiqon 公司制作，上海康成生物工程有限公司代 理 ；DU-730 紫 外 分 光 光 度 计 和 PRISM 7900 实 时 荧 光 定 量 PCR 仪 （ABI 公 司 ，美 国 ）；miR-122 及 U6 引 物序列由阅微基因技术有限公司合成。 1.3 药物干预