用于脉冲场凝胶电泳指纹图谱分析的分区条带计数法的建立_陈洪友_屠丽红_陈敏_宋元
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在使用 BN 软件和分区条带计数法分析时，标本 酶切后产生的电泳条带的辨别采用相同的标准。条 带识别参照电泳原始图片，以肉眼观察判断为准。为 统一标准对部分情况作相同处理，典型的单条条带应 两端呈钝圆型，且条带内部色调均匀； 两端平齐但条 带内部色调均一的条带计为 1 条条带； 两端呈“Σ”型 内陷且条带中间较上下部分色调偏浅的条带计为 2 条条带； 部分条带表现为上部颜色深下部颜色浅计为 2 条条带（ 表 1） 。对于出现在泳道中、上部颜色明显弱 于其他条带的条带（ ghost band） 一般不作为条带计数。
以与标本处同一凝胶的 H9812 XbaI 酶切产生的 398． 4 Kb、310． 1 Kb、216． 9 Kb、138． 9 Kb 和 76． 8 Kb 5 个条带为分区参照条带，将标本所在的泳道划分为 A ～ F 6 个区段。将同一图片中临近的 2 个 H9812 的 泳道上对应的分区参照条带两端连线，然后计数各标 本在各区段内的条带数量。除位于 668． 9 Kb 的条带 外，当待分型标本有条带恰好位于参照条带的连线上 时，该条带将计入连线之上的区段中，不计数长度小 于 20． 5 Kb 的条带。计数标本所在泳道内总条带数， 用于核实分区计数的条带数量的正确性（ 图 1） 。
簇： 同一分型方法中，判为同一型的图谱且菌株
数≥2 的定为 1 簇。
分析方法的区分能力： 使用 Simpson’s 多样性指 数［3］（ DI） 来反映分析方法对菌株的区分能力，DI = 1
－
∑n（ n － 1） N（ N － 1）
，其中
N
为菌株总数，n
为各型菌株数。
H9812 为 H9812 沙门菌 XbaI 酶切图谱，1 ～ 11 为 VP 的 NotI 酶切图谱
图 1 分区参照位置及条带计数方法
2 结果 分区条带计数法和 BN 聚类分析 2 种方法对于
不同血清型的菌株均能进行很好地区分，均未发现不
2014 年第 26 卷第 9 期 2014，Vol． 26 No． 9
上海预防医学 Shanghai Journal of Preventive Medicine
法能大大减少肉眼观察的图谱数量，具有操作简便、成本低、对软件依赖性小、结果显示简单直接的特点，能直观反映
菌株条带的分布特征，因此应能满足分型信息共享与交流的要求。
关键词： 分子分型; 指纹图谱; 脉冲场凝胶电泳
中图分类号： Ｒ 37 文献标志码： A
Partition bands counting established for PFEG fingerprint analysis CHEN Hong-you，TU Li-hong， CHEN Min，SONG Yuan-jun，ZHANG Xi（ Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shanghai 200336，China）
在 Excel 表格中，以 A ～ F 作为变量输入标本所 在泳道各区段条带的计数结果，按 A ～ F 变量对菌株 进行排序，肉眼比较各区段条带计数完全相同的菌株 图谱，将分区计数相同但条带位置存在差异的菌株由 1 开始编写亚型，该亚型结果作为第 7 个变量，记为 G。以 A ～ G 变量内的数字形成的字符串作为菌株的 PFGE 型别的判断依据。 1． 4 标本酶切条带的辨别
PFGE 产生的图谱以 BN（ 6． 0 版） 按 PulseNet 标 准程序进行分析。建立 VP 指纹图谱数据库后在数 据库中安装 China Master Scripts v5． 01 插件，以插件 提供的 H9812 XbaI 酶切图谱作为外参照，对比与标 本处同一凝胶的 H9812 XbaI 酶切图谱将标本酶切片 段的位置进行标准化。图谱的聚类分析以 Dice 法计 算菌株图谱的相似度，以非加权平均数法（ unweighted pair － group method with arithmetic means，UPGMA） 生 成系统发育树，图谱优化度和位置比较容忍度均设为 1． 5% 。 1． 3 分区条带计数法分析图谱
条带数 1 1 2 2
表 1 条带的识别与计数
条带性状
描述 两端钝圆
两端平齐
两Biblioteka Baidu有内陷
上深下浅
1． 5 结果判断
BN 分析型（ BN 型） ： 利用 BN 软件对菌株图谱进
行聚类，相似度为 100% 的标本图谱定义为同一型。
分区条带计数型（ BC 型） ： 分区条带计数法分析
中，各区段条带数量和亚型相同的图谱定义为同一型。
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上海预防医学 Shanghai Journal of Preventive Medicine
2014 年第 26 卷第 9 期 2014，Vol． 26 No． 9
1 材料与方法 1． 1 测试菌株 PFGE 指纹图谱的获取
44 株副溶血性弧菌（ VP） 按照 PulseNet 推荐的 标准操作规程进行 PFGE 分型［2］。VP DNA 以限制 性内切酶 NotI 处理 3 h，脉冲时间设为 10 ～ 35 s，电泳 18． 5 h 后，凝胶以 GelＲed（ Biotium，美国） 染色30 min， 紫外下拍照，图谱以 TIFF 格式保存。内参照菌株为 沙门菌 H9812 DNA 的 XbaI 酶切产物，随同待测菌株 一起电泳。每 2 个内参照之间放置 3 ～ 4 株待分型标 本。 1． 2 BN 内图谱分析
常用 的 软 件 是 BioNumerics （ BN，比 利 时 Applied Maths 公司产品） 。受知识产权协议保护，BN 软件的 价格相对比较昂贵，对基层单位可及性差。此外，尽 管部分指纹图谱技术已实现操作程序及参照体系的 标准 化 （ http： / / www． pulsenetinternational． org / protocols） ，但不同实验室间指纹图谱的比对仍依赖于 BN 软件，在一定程度上限制了指纹图谱技术应用和结果 分享的范围。因此，我们以 PFGE 的指纹图谱分析为 例，尝试使用分区条带计数法将指纹图谱转化成字符 串，从而摆脱 BN 软件实现室内和室间指纹图谱的直 接比对。
Abstract： ［Objective］ To establish a new method for PFGE fingerprint analysis，which is easy-tooperate，inexpensive，software-low-dependent and readily-exchangeable． ［Methods］ A group of 44 vibrio parahaemolyticus was subtyped according to PulseNet standardized PFGE protocol． The fingerprint was analyzed with new gel-partition bands counting method and BioNumerics clustering separately and then the results by the two methods were compared with type number，cluster number and Simpson’s Index of Diversity （ DI） ． ［Ｒesults］ The 44 isolates could be typed into 32 types and 5 clusters were found by gel-partition bands counting method （ DI = 97． 6% ） ． BioNumerics could type the same isolates into 29 types and 4 clusters were found （ DI = 95． 5% ） ． The difference in the ability of finding clusters between the two methods was not statistically significant． ［Conclusion］ Gel-partition bands counting method is based on the bands distribution among finger print and greatly reduces the number of visually observed spectrum， which is easy-to-operate，inexpensive，software-low-dependent and readily-exchangeable．
陈洪友，屠丽红，陈敏，宋元君，张曦 （ 上海市疾病预防控制中心，上海 200336）
摘要： ［目的］ 建立操作简便、软件依赖性低、结果易于交流的脉冲场凝胶电泳（ PFGE） 指纹图谱分析新方法。
［方法］ 按 PulseNet 标准操作规程，对 44 株副溶血性弧菌进行 PFGE 分型试验，分别利用分区条带计数法和 BioN-
在发现菌株成簇的能力上，2 种分析方法成簇的 差异无统计学意义（ χ2 = 0． 5，P ＞ 0． 05） 。使用分区 条带计数法能发现 5 簇（ Ca ～ Ce） ，BN 能发现 4 簇 （ CI ～ CIV） 。BN 聚类分析中，BN18 型和 BN19 型中
Key words： Molecular subtyping； Fingerprint； PFGE
在细菌性疾病爆发疫情调查中，探讨菌株 A 与 菌株 B 是否具有关联性，除了传统方法外，细菌的分 子分型技术起到越来越重要的作用［1］。指纹图谱技 术，如脉冲场凝胶电泳（ PFGE） 、限制性片段长度多 态性（ ＲFLP） 、随机扩增多态性 PCＲ（ ＲAPD） 、回文序 列 PCＲ（ Ｒep － PCＲ） 等，是目前常用的细菌分子分型 技术，但其数据分析一般都需要特殊的软件，目前最
umerics 软件对图谱进行分析，并以型别数、成簇数和 Simpson’s 多样性指数（ DI） 对 2 种分析方法进行比较。 ［结
果］ 分区条带计数法可将 44 株菌分为 32 个型（ DI = 97． 6% ） ，能发现 5 簇。BioNumerics 聚类分析可分为 29 个 BN
型（ DI = 95． 5% ） ，能发现 4 簇。在发现菌株成簇的能力上，2 种分析方法的差异无统计学意义。 ［结论］ 条带计数
2014 年第 26 卷第 9 期 2014，Vol． 26 No． 9
上海预防医学 Shanghai Journal of Preventive Medicine
文章编号： 1004 － 9231（ 2014） 09 － 0465 － 04
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·论 著·
用于脉冲场凝胶电泳指纹图谱分析的分区条带计数法的建立
基金项目： 上海市卫生局青年科研项目（ 2010Y105） ； “十二五” 国家科技重大专项 －“艾滋病和病毒性肝炎等重大 传染病防治”（ 2013ZX10004216 － 001 － 004） 。
作者简介： 陈洪友（ 1978— ） ，男，主管医师，硕士。 通信作者： 陈敏，副主任技师。Email： mchen@ scdc． sh． cn。
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同的血清型具有相同的型别，但对相同血清型菌株的 区分存在差异。不考虑亚型（ G） 时，使用分区条带计 数法可将 44 株 VP 分为 28 个型（ DI = 92． 1% ） ，有 12 株 O3∶ K6 血清型的 VP 其 A ～ F 分区条带数量相同 （ 3 － 2 － 3 － 3 － 1 － 5） ，但实际在分区内部条带的位 置有 3 处存在差异。将亚型纳入分型时，分区条带计 数法可将同样菌株分为 32 个型（ DI = 97． 6% ） ，上述 12 株 VP 获得较好的区分。BN 聚类分析可将测试菌 株分为 29 个 BN 型（ DI = 95． 5% ） ，但肉眼观察可见 BN18 型和 19 型内部并不是全为相同的型别（ 表 2） 。
以与标本处同一凝胶的 H9812 XbaI 酶切产生的 398． 4 Kb、310． 1 Kb、216． 9 Kb、138． 9 Kb 和 76． 8 Kb 5 个条带为分区参照条带，将标本所在的泳道划分为 A ～ F 6 个区段。将同一图片中临近的 2 个 H9812 的 泳道上对应的分区参照条带两端连线，然后计数各标 本在各区段内的条带数量。除位于 668． 9 Kb 的条带 外，当待分型标本有条带恰好位于参照条带的连线上 时，该条带将计入连线之上的区段中，不计数长度小 于 20． 5 Kb 的条带。计数标本所在泳道内总条带数， 用于核实分区计数的条带数量的正确性（ 图 1） 。
簇： 同一分型方法中，判为同一型的图谱且菌株
数≥2 的定为 1 簇。
分析方法的区分能力： 使用 Simpson’s 多样性指 数［3］（ DI） 来反映分析方法对菌株的区分能力，DI = 1
－
∑n（ n － 1） N（ N － 1）
，其中
N
为菌株总数，n
为各型菌株数。
H9812 为 H9812 沙门菌 XbaI 酶切图谱，1 ～ 11 为 VP 的 NotI 酶切图谱
图 1 分区参照位置及条带计数方法
2 结果 分区条带计数法和 BN 聚类分析 2 种方法对于
不同血清型的菌株均能进行很好地区分，均未发现不
2014 年第 26 卷第 9 期 2014，Vol． 26 No． 9
上海预防医学 Shanghai Journal of Preventive Medicine
法能大大减少肉眼观察的图谱数量，具有操作简便、成本低、对软件依赖性小、结果显示简单直接的特点，能直观反映
菌株条带的分布特征，因此应能满足分型信息共享与交流的要求。
关键词： 分子分型; 指纹图谱; 脉冲场凝胶电泳
中图分类号： Ｒ 37 文献标志码： A
Partition bands counting established for PFEG fingerprint analysis CHEN Hong-you，TU Li-hong， CHEN Min，SONG Yuan-jun，ZHANG Xi（ Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shanghai 200336，China）
在 Excel 表格中，以 A ～ F 作为变量输入标本所 在泳道各区段条带的计数结果，按 A ～ F 变量对菌株 进行排序，肉眼比较各区段条带计数完全相同的菌株 图谱，将分区计数相同但条带位置存在差异的菌株由 1 开始编写亚型，该亚型结果作为第 7 个变量，记为 G。以 A ～ G 变量内的数字形成的字符串作为菌株的 PFGE 型别的判断依据。 1． 4 标本酶切条带的辨别
PFGE 产生的图谱以 BN（ 6． 0 版） 按 PulseNet 标 准程序进行分析。建立 VP 指纹图谱数据库后在数 据库中安装 China Master Scripts v5． 01 插件，以插件 提供的 H9812 XbaI 酶切图谱作为外参照，对比与标 本处同一凝胶的 H9812 XbaI 酶切图谱将标本酶切片 段的位置进行标准化。图谱的聚类分析以 Dice 法计 算菌株图谱的相似度，以非加权平均数法（ unweighted pair － group method with arithmetic means，UPGMA） 生 成系统发育树，图谱优化度和位置比较容忍度均设为 1． 5% 。 1． 3 分区条带计数法分析图谱
条带数 1 1 2 2
表 1 条带的识别与计数
条带性状
描述 两端钝圆
两端平齐
两Biblioteka Baidu有内陷
上深下浅
1． 5 结果判断
BN 分析型（ BN 型） ： 利用 BN 软件对菌株图谱进
行聚类，相似度为 100% 的标本图谱定义为同一型。
分区条带计数型（ BC 型） ： 分区条带计数法分析
中，各区段条带数量和亚型相同的图谱定义为同一型。
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上海预防医学 Shanghai Journal of Preventive Medicine
2014 年第 26 卷第 9 期 2014，Vol． 26 No． 9
1 材料与方法 1． 1 测试菌株 PFGE 指纹图谱的获取
44 株副溶血性弧菌（ VP） 按照 PulseNet 推荐的 标准操作规程进行 PFGE 分型［2］。VP DNA 以限制 性内切酶 NotI 处理 3 h，脉冲时间设为 10 ～ 35 s，电泳 18． 5 h 后，凝胶以 GelＲed（ Biotium，美国） 染色30 min， 紫外下拍照，图谱以 TIFF 格式保存。内参照菌株为 沙门菌 H9812 DNA 的 XbaI 酶切产物，随同待测菌株 一起电泳。每 2 个内参照之间放置 3 ～ 4 株待分型标 本。 1． 2 BN 内图谱分析
常用 的 软 件 是 BioNumerics （ BN，比 利 时 Applied Maths 公司产品） 。受知识产权协议保护，BN 软件的 价格相对比较昂贵，对基层单位可及性差。此外，尽 管部分指纹图谱技术已实现操作程序及参照体系的 标准 化 （ http： / / www． pulsenetinternational． org / protocols） ，但不同实验室间指纹图谱的比对仍依赖于 BN 软件，在一定程度上限制了指纹图谱技术应用和结果 分享的范围。因此，我们以 PFGE 的指纹图谱分析为 例，尝试使用分区条带计数法将指纹图谱转化成字符 串，从而摆脱 BN 软件实现室内和室间指纹图谱的直 接比对。
Abstract： ［Objective］ To establish a new method for PFGE fingerprint analysis，which is easy-tooperate，inexpensive，software-low-dependent and readily-exchangeable． ［Methods］ A group of 44 vibrio parahaemolyticus was subtyped according to PulseNet standardized PFGE protocol． The fingerprint was analyzed with new gel-partition bands counting method and BioNumerics clustering separately and then the results by the two methods were compared with type number，cluster number and Simpson’s Index of Diversity （ DI） ． ［Ｒesults］ The 44 isolates could be typed into 32 types and 5 clusters were found by gel-partition bands counting method （ DI = 97． 6% ） ． BioNumerics could type the same isolates into 29 types and 4 clusters were found （ DI = 95． 5% ） ． The difference in the ability of finding clusters between the two methods was not statistically significant． ［Conclusion］ Gel-partition bands counting method is based on the bands distribution among finger print and greatly reduces the number of visually observed spectrum， which is easy-to-operate，inexpensive，software-low-dependent and readily-exchangeable．
陈洪友，屠丽红，陈敏，宋元君，张曦 （ 上海市疾病预防控制中心，上海 200336）
摘要： ［目的］ 建立操作简便、软件依赖性低、结果易于交流的脉冲场凝胶电泳（ PFGE） 指纹图谱分析新方法。
［方法］ 按 PulseNet 标准操作规程，对 44 株副溶血性弧菌进行 PFGE 分型试验，分别利用分区条带计数法和 BioN-
在发现菌株成簇的能力上，2 种分析方法成簇的 差异无统计学意义（ χ2 = 0． 5，P ＞ 0． 05） 。使用分区 条带计数法能发现 5 簇（ Ca ～ Ce） ，BN 能发现 4 簇 （ CI ～ CIV） 。BN 聚类分析中，BN18 型和 BN19 型中
Key words： Molecular subtyping； Fingerprint； PFGE
在细菌性疾病爆发疫情调查中，探讨菌株 A 与 菌株 B 是否具有关联性，除了传统方法外，细菌的分 子分型技术起到越来越重要的作用［1］。指纹图谱技 术，如脉冲场凝胶电泳（ PFGE） 、限制性片段长度多 态性（ ＲFLP） 、随机扩增多态性 PCＲ（ ＲAPD） 、回文序 列 PCＲ（ Ｒep － PCＲ） 等，是目前常用的细菌分子分型 技术，但其数据分析一般都需要特殊的软件，目前最
umerics 软件对图谱进行分析，并以型别数、成簇数和 Simpson’s 多样性指数（ DI） 对 2 种分析方法进行比较。 ［结
果］ 分区条带计数法可将 44 株菌分为 32 个型（ DI = 97． 6% ） ，能发现 5 簇。BioNumerics 聚类分析可分为 29 个 BN
型（ DI = 95． 5% ） ，能发现 4 簇。在发现菌株成簇的能力上，2 种分析方法的差异无统计学意义。 ［结论］ 条带计数
2014 年第 26 卷第 9 期 2014，Vol． 26 No． 9
上海预防医学 Shanghai Journal of Preventive Medicine
文章编号： 1004 － 9231（ 2014） 09 － 0465 － 04
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用于脉冲场凝胶电泳指纹图谱分析的分区条带计数法的建立
基金项目： 上海市卫生局青年科研项目（ 2010Y105） ； “十二五” 国家科技重大专项 －“艾滋病和病毒性肝炎等重大 传染病防治”（ 2013ZX10004216 － 001 － 004） 。
作者简介： 陈洪友（ 1978— ） ，男，主管医师，硕士。 通信作者： 陈敏，副主任技师。Email： mchen@ scdc． sh． cn。
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同的血清型具有相同的型别，但对相同血清型菌株的 区分存在差异。不考虑亚型（ G） 时，使用分区条带计 数法可将 44 株 VP 分为 28 个型（ DI = 92． 1% ） ，有 12 株 O3∶ K6 血清型的 VP 其 A ～ F 分区条带数量相同 （ 3 － 2 － 3 － 3 － 1 － 5） ，但实际在分区内部条带的位 置有 3 处存在差异。将亚型纳入分型时，分区条带计 数法可将同样菌株分为 32 个型（ DI = 97． 6% ） ，上述 12 株 VP 获得较好的区分。BN 聚类分析可将测试菌 株分为 29 个 BN 型（ DI = 95． 5% ） ，但肉眼观察可见 BN18 型和 19 型内部并不是全为相同的型别（ 表 2） 。