色谱柱基础知识简介
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填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。
2020/5/12
10
色谱柱的正确使用
• 加装保护柱：保护柱属消耗品,经过一定次数的
样品分析(50~100次)后,出现柱压显著升高或峰形 变坏或基线漂移时,应考虑更换保护柱。
• 过滤流动相和样品 ：流动相通常由水或缓冲溶
液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的 流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而 有所区别
Fra Baidu bibliotek
2020/5/12
12
• 注意温度和酸碱度 ：一般以硅胶为基质的色谱柱
最高使用温度不超过60℃,以低于40℃为宜,特别是 在流动相pH接近使用限度时,更应降低使用温度。 目前的键合硅胶色谱柱标示的pH适用范围可达 2~10,但在实际使用时应避免极端的pH条件,特别是 在偏碱性的条件(pH≥8)下使用，如必须要在极端的 pH条件下使用时,可通过以下方法避免柱损害: (1)在 泵和进样阀之间加装预柱(饱和柱)来饱和流动相(2) 降低使用温度(3)检验完毕后立即用与所使用的流动 相互相混溶的“温和溶剂”彻底清洗。
2020/5/12
17
• 离子交换柱的再生。长时间在高pH值和高 离子强度缓冲溶液中使用，将导致色谱柱 离子交换能力降低。用稀酸缓冲溶液冲洗， 可使阳离子柱再生;反之，用稀碱缓冲溶液 冲洗，可使阴离子柱再生。
• 其他色谱柱的再生 。
2020/5/12
18
谢谢
2020/5/12
19
2020/5/12
11
• 净化样品 ：样品中含有对色谱柱有损害的化学
成分,如产生永久性吸附的蛋白质、糖等有机分子 和强吸附性物质,以及可能对柱填料产生破坏作用 的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离 提纯以除去多余杂质组分。
• 避免过高的柱压 ：避免的方法是(1)柱压过高时,
尽可能采用较小的流速,以不超过柱最大允许压力 的一半为宜。(2)当流速较大时,应采取流速梯度的 办法使流速分步到位。(3)使用手动进样阀时,进样 阀的切换要尽可能的快。
行适当的处理后保存。
2020/5/12
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色谱柱的老化
• 目的：除去溶剂、水分、以及色谱柱制备过程中其他挥发 性杂质；促进固定液均匀牢固的分布在担体上。
• 老化方法（略） • 老化温度的选择应注意：足够高以除去不挥发物质；足够
低以延长柱寿命和减少柱流失；温度越低老化时间应越长； 不超过色谱柱的最高使用温度 • 填充柱比毛细管柱应更经常、更严格的老化 • 填充柱老化时间应长些，可过夜；毛细管柱老化只能是轻 度的，时间应短些，防止固定液流失。 • 老化好的色谱柱若不立即投入使用，应将其从柱箱中取出， 两端盖上帽子，防止空气、水分或其他杂质的进入。
产品
• 此外Merk公司和Mecherey-Nagel公司也是世界知 名的色谱填料和色谱柱生产厂家。
2020/5/12
4
色谱柱的构成
• 色谱柱由柱管、压帽、卡套(密 封环)、筛板(滤片)、接头、螺 丝等组成。柱管多用不锈钢制 成，压力不高于70kkg/cm2时， 也可采用厚壁玻璃或石英管， 管内壁要求有很高的光洁度 。
2020/5/12
3
• 国外比较知名的品牌有： • 安捷伦公司的Zorbax系列填料柱, • Water公司的μBondapak系列填料柱, • 美国Supelco公司的Supelco柱, • 瑞典AkzoNobel公司的Kroma-sil填料柱, • 迪马公司的Diamonsil柱以及部分日本岛津公司的
0.5~10米 2~4mm
大，通常10~50ml/min
10~150米
0.25mm、0.38mm、 0.50mm 小，通常0.5~5ml/min
样品容量
2020/5/12
大，可加大进样量
小，通常需要分流进样 口
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填充柱(铜&不锈钢材料)
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填充柱(玻璃材料)
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8
毛细管柱
2020/5/12
2
• 色谱柱是高效液相色谱的心脏，在高效液相色谱 仪的使用中，保持色谱柱的柱效、容量和渗透特
性，延长柱子的使用寿命非常重要。尽管经过数 十年的发展,出现了各种各样的专用色谱柱,如制备 柱、分析柱和各种微型柱,但色谱柱主体上仍由柱 体、柱内填料和两端的接头组成。由于使用了高 效填料,并不需要很长的柱长,常规分析柱多为 15~30 cm的直型柱。由于高效液相色谱柱要承受 系统高压,所以柱体一般选用金属材质。大部分色 谱柱的接头为通用尺寸,可互换使用。
高效液相色谱柱知识介绍
2013.12
2020/5/12
1
色谱柱的发展现状
• 高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期 发展起来的分离分析技术，是现代分离测 定的重要手段。问世以来，因其具有分离 效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能 分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活 性物质的特点而被广泛应用于生物化学、 药物及临床分析。
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13
• 正确及时的冲洗：始试验前,应了解柱中当前是
何种溶剂。对于新色谱柱,如无特殊说明均为评价
报告中所用流动相。柱中当前溶剂一定要与分析 样品所用流动相互溶,如不能混溶,要用与二者均能
相互混溶的第三种溶剂过渡。异丙醇是唯一能与 各种溶剂混溶的试剂,可作为中介流动相使用。对 于含有缓冲盐的流动相,最好的办法是先用与分析
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色谱柱的再生
• 反相柱的再生。采用以甲醇:水=95:5(V/V)，纯甲 醇，二氯甲烷等溶剂作流动相，顺次冲洗，每种 流动相流经色谱柱的量为20一30倍色谱柱体积然 后再以相反顺序冲洗色谱柱。
• 正相柱再生。顺次以正己烷、异丙醇、二氯甲烷、 甲醇作流动相冲洗色谱柱每步注意平衡溶剂的顺 序，不要颠倒每种流动相流经色谱柱的量为20— 30倍柱体积(因异丙醇的粘度较大，冲洗过程中请 随时注意调整冲洗的流速)，用甲醇冲洗完后，再 以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必需 严格脱水。
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9
色谱柱按用途可分为分析型和制备型
常用的色谱柱及其尺寸：
• (1)常规分析柱(常量柱)，内径2—smm(常用4.6mm，国内 有4mm和5mm)，柱长10—30cm;
• (2)窄径柱，又称细管径柱、半微柱，内径1—2mm，柱长 10—20cm;
• (3)毛细管柱(又称微柱)，内径0.2—0.5mm; • (4)半制备柱，内径>5mm; • (5)实验室制备柱，内径20—40mm,柱长10—30cm; • (6)生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、
用流动相组成完全相同但不含缓冲盐的溶液进行 冲洗,再逐步过渡到纯甲醇冲洗。
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色谱柱的维护
• 柱的安装与拆卸 ：色谱柱属易耗品,需要不 断更换
• 柱污染的处理 ：常见的柱污染有柱头烧结 滤板堵塞、柱头内填料污染和柱内有盐结 晶析出。
• 柱塌陷的处理 • 柱的贮存与管理 ：色谱柱长期不用时,应进
• 色谱柱两端的柱接头内装有筛 板，是烧结不锈钢或钦合金， 孔径0.2一20µm(5一10µm)，取 决于填料粒度，目的是防止填 料漏出
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5
色谱柱的分类
• 通常使用填充柱和毛细管柱两类
两类色谱柱的区别
项目
填充柱
毛细管柱
柱材料
柱长 柱内径 柱流速
铜、不锈钢、硅酸硼玻 常用熔凝硅玻璃 璃
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色谱柱的正确使用
• 加装保护柱：保护柱属消耗品,经过一定次数的
样品分析(50~100次)后,出现柱压显著升高或峰形 变坏或基线漂移时,应考虑更换保护柱。
• 过滤流动相和样品 ：流动相通常由水或缓冲溶
液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的 流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而 有所区别
Fra Baidu bibliotek
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• 注意温度和酸碱度 ：一般以硅胶为基质的色谱柱
最高使用温度不超过60℃,以低于40℃为宜,特别是 在流动相pH接近使用限度时,更应降低使用温度。 目前的键合硅胶色谱柱标示的pH适用范围可达 2~10,但在实际使用时应避免极端的pH条件,特别是 在偏碱性的条件(pH≥8)下使用，如必须要在极端的 pH条件下使用时,可通过以下方法避免柱损害: (1)在 泵和进样阀之间加装预柱(饱和柱)来饱和流动相(2) 降低使用温度(3)检验完毕后立即用与所使用的流动 相互相混溶的“温和溶剂”彻底清洗。
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• 离子交换柱的再生。长时间在高pH值和高 离子强度缓冲溶液中使用，将导致色谱柱 离子交换能力降低。用稀酸缓冲溶液冲洗， 可使阳离子柱再生;反之，用稀碱缓冲溶液 冲洗，可使阴离子柱再生。
• 其他色谱柱的再生 。
2020/5/12
18
谢谢
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19
2020/5/12
11
• 净化样品 ：样品中含有对色谱柱有损害的化学
成分,如产生永久性吸附的蛋白质、糖等有机分子 和强吸附性物质,以及可能对柱填料产生破坏作用 的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离 提纯以除去多余杂质组分。
• 避免过高的柱压 ：避免的方法是(1)柱压过高时,
尽可能采用较小的流速,以不超过柱最大允许压力 的一半为宜。(2)当流速较大时,应采取流速梯度的 办法使流速分步到位。(3)使用手动进样阀时,进样 阀的切换要尽可能的快。
行适当的处理后保存。
2020/5/12
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色谱柱的老化
• 目的：除去溶剂、水分、以及色谱柱制备过程中其他挥发 性杂质；促进固定液均匀牢固的分布在担体上。
• 老化方法（略） • 老化温度的选择应注意：足够高以除去不挥发物质；足够
低以延长柱寿命和减少柱流失；温度越低老化时间应越长； 不超过色谱柱的最高使用温度 • 填充柱比毛细管柱应更经常、更严格的老化 • 填充柱老化时间应长些，可过夜；毛细管柱老化只能是轻 度的，时间应短些，防止固定液流失。 • 老化好的色谱柱若不立即投入使用，应将其从柱箱中取出， 两端盖上帽子，防止空气、水分或其他杂质的进入。
产品
• 此外Merk公司和Mecherey-Nagel公司也是世界知 名的色谱填料和色谱柱生产厂家。
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色谱柱的构成
• 色谱柱由柱管、压帽、卡套(密 封环)、筛板(滤片)、接头、螺 丝等组成。柱管多用不锈钢制 成，压力不高于70kkg/cm2时， 也可采用厚壁玻璃或石英管， 管内壁要求有很高的光洁度 。
2020/5/12
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• 国外比较知名的品牌有： • 安捷伦公司的Zorbax系列填料柱, • Water公司的μBondapak系列填料柱, • 美国Supelco公司的Supelco柱, • 瑞典AkzoNobel公司的Kroma-sil填料柱, • 迪马公司的Diamonsil柱以及部分日本岛津公司的
0.5~10米 2~4mm
大，通常10~50ml/min
10~150米
0.25mm、0.38mm、 0.50mm 小，通常0.5~5ml/min
样品容量
2020/5/12
大，可加大进样量
小，通常需要分流进样 口
6
填充柱(铜&不锈钢材料)
2020/5/12
7
填充柱(玻璃材料)
2020/5/12
8
毛细管柱
2020/5/12
2
• 色谱柱是高效液相色谱的心脏，在高效液相色谱 仪的使用中，保持色谱柱的柱效、容量和渗透特
性，延长柱子的使用寿命非常重要。尽管经过数 十年的发展,出现了各种各样的专用色谱柱,如制备 柱、分析柱和各种微型柱,但色谱柱主体上仍由柱 体、柱内填料和两端的接头组成。由于使用了高 效填料,并不需要很长的柱长,常规分析柱多为 15~30 cm的直型柱。由于高效液相色谱柱要承受 系统高压,所以柱体一般选用金属材质。大部分色 谱柱的接头为通用尺寸,可互换使用。
高效液相色谱柱知识介绍
2013.12
2020/5/12
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色谱柱的发展现状
• 高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期 发展起来的分离分析技术，是现代分离测 定的重要手段。问世以来，因其具有分离 效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能 分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活 性物质的特点而被广泛应用于生物化学、 药物及临床分析。
2020/5/12
13
• 正确及时的冲洗：始试验前,应了解柱中当前是
何种溶剂。对于新色谱柱,如无特殊说明均为评价
报告中所用流动相。柱中当前溶剂一定要与分析 样品所用流动相互溶,如不能混溶,要用与二者均能
相互混溶的第三种溶剂过渡。异丙醇是唯一能与 各种溶剂混溶的试剂,可作为中介流动相使用。对 于含有缓冲盐的流动相,最好的办法是先用与分析
2020/5/12
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色谱柱的再生
• 反相柱的再生。采用以甲醇:水=95:5(V/V)，纯甲 醇，二氯甲烷等溶剂作流动相，顺次冲洗，每种 流动相流经色谱柱的量为20一30倍色谱柱体积然 后再以相反顺序冲洗色谱柱。
• 正相柱再生。顺次以正己烷、异丙醇、二氯甲烷、 甲醇作流动相冲洗色谱柱每步注意平衡溶剂的顺 序，不要颠倒每种流动相流经色谱柱的量为20— 30倍柱体积(因异丙醇的粘度较大，冲洗过程中请 随时注意调整冲洗的流速)，用甲醇冲洗完后，再 以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必需 严格脱水。
2020/5/12
9
色谱柱按用途可分为分析型和制备型
常用的色谱柱及其尺寸：
• (1)常规分析柱(常量柱)，内径2—smm(常用4.6mm，国内 有4mm和5mm)，柱长10—30cm;
• (2)窄径柱，又称细管径柱、半微柱，内径1—2mm，柱长 10—20cm;
• (3)毛细管柱(又称微柱)，内径0.2—0.5mm; • (4)半制备柱，内径>5mm; • (5)实验室制备柱，内径20—40mm,柱长10—30cm; • (6)生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、
用流动相组成完全相同但不含缓冲盐的溶液进行 冲洗,再逐步过渡到纯甲醇冲洗。
2020/5/12
14
色谱柱的维护
• 柱的安装与拆卸 ：色谱柱属易耗品,需要不 断更换
• 柱污染的处理 ：常见的柱污染有柱头烧结 滤板堵塞、柱头内填料污染和柱内有盐结 晶析出。
• 柱塌陷的处理 • 柱的贮存与管理 ：色谱柱长期不用时,应进
• 色谱柱两端的柱接头内装有筛 板，是烧结不锈钢或钦合金， 孔径0.2一20µm(5一10µm)，取 决于填料粒度，目的是防止填 料漏出
2020/5/12
5
色谱柱的分类
• 通常使用填充柱和毛细管柱两类
两类色谱柱的区别
项目
填充柱
毛细管柱
柱材料
柱长 柱内径 柱流速
铜、不锈钢、硅酸硼玻 常用熔凝硅玻璃 璃