大米中蛋白质含量的测定

大米中蛋白质含量的测定 Prepared on 24 November 2020

目的意义：水稻是重要的粮食作物之一，其品质优劣是值得人们重视的问题。一个高产水稻品种，往往由于食味差、或营养不丰富，而不受大众的欢迎。因此，在保证高产的同时，还要改善稻米的品质。本实验将测定大米品质的几个重要生化指标，为水稻育种提供理论依据。

Ⅰ大米蛋白质含量的测定——考马斯亮兰G—250法

一、原理

考马斯亮G—250是一种染料，在游离状态下呈红色，在465nm波长处有最大光吸收。它能与蛋白质稳定结合，结合蛋白质后变为青色，在595nm处有最大吸收，在一定蛋白质浓度范围内（0～1000μg/ml），蛋白质—色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。该法反应迅速，蛋白质与考马斯亮兰G—250的结合反应能在2分钟内达到平衡。结合物在室温下1小时内保持稳定，反应非常灵敏，可测出微克级蛋白质含量，是最近新发展起来的一种较理想的蛋白质定量法。

二、实验材料、仪器及试剂

1．仪器：

721型分光光度计离心机 50ml容量瓶 10ml刻度试管研钵量筒移液管

2．试剂：

（1）牛血清白蛋白（1000μg/ml）：称取牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，配制成标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮兰G-250溶液：称取100ml考马斯亮兰G—250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到

1000ml，过滤，常温下可放置1个月。

（3）LnaOH：称取4g氢氧化纳，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。

3．材料：大米粉

三、实验方法

1．标准曲线的制作：

取6只10ml刻度试管，编号，按下表数据配制牛血清白蛋白标准溶液。准确吸取上述各管溶液，对应放于另外6支10ml刻度试管中，加入5ml考马斯亮兰G-250溶液，盖塞，将试管中溶液给向倒转混合，放置2分钟后，用10mm 光径的比色杯在595nm波长下比色。以光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度值为横坐标，制作出标准曲线。

2．样品中蛋白质提取：

（1）准确称取稻米粉克，放入研钵中，加L NaOH，研磨成匀浆，转入到10ml 离心管中，再用6ml L NaOH分三次洗涤研钵，洗液一并转入10ml离心管中，用玻棒搅拌，放置30分钟，放置过程间断搅动数次。3500rpm离心15分钟，上清液转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀，得碱溶性蛋白。

（2）将上述沉淀用70%乙醇重复提取，操作步骤同上，得醇溶性蛋白。3．测定：

吸取提取液，放入10ml具塞刻度试管中，加5ml考马斯亮兰G-250试剂，混匀，放置2分钟，用10mm光径的比色杯在595nm波长下比色（比色空白用蒸馏水代替提取液与5ml考马斯亮兰G-250试剂混合），记录OD值。然后根据所测OD595nm在标准曲线上查出所对应的蛋白质浓度（C）。四、结果计算：

五、注意事项：（1）由于此方法十分灵敏，因此，所用器皿必须清洗干净，取样必须准确，否则会造成很大的误差。（2）定容时蒸馏水要沿着管壁缓慢加入，以免产生大量气泡，造成定容不准确，实验也会出现误差。（3）谷物种子蛋白质主要是谷蛋白和醇溶蛋白，因此，稻米粉蛋白含量应为碱溶性谷蛋白和醇溶性蛋白含量之和。