食品中糖的测定方法

食品中糖的测定方法
对于糖的测定方法有很多，大致可分为三类
1.物理法，（1.旋光法, 2 .折光法, 3.比重法,）
2.物理化学法,(1.点位法, 2极普法,
3.光度法,
4.色谱法)
3.化学方法,(1.斐林氏法. 2.高锰酸钾法. 3.碘量法.
4.铁氰化钾法.
5.蒽铜比色法.
6.咔唑比色法)
共计三大种，在测定其他碳水化合物时，往往是使其水解为糖再进行测定。

一. 总糖的测定
食品中的总糖主要指具有还原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在测定条件下能水解为
还原性的单糖的蔗糖（水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖），麦芽糖（水解后为2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后为2分子葡萄糖）。

还原糖类之所以具有还原性是由于分子中含有游离的醛基（-CHO）或酮基(=C=O)。

测定总糖的经典化学方法都是以其能被各种试剂氧化为基础的。

这些方法中，以各种根据斐林氏溶液的氧化作用的改进法的应用范围最广。

在这里我们主要给大家介绍铁氰化钾法，蒽铜比色法，斐林氏容量法。

斐林氏容量法由于反应复杂，影响因素较多，所以不如铁氰化钾法准确，但其操作简单迅速，试剂稳定，故被广泛采用。

蒽铜比色法要求比色时糖液浓度在一定范围内，但要求检测液澄清，此外，在大多数情况下，测定要求不包括淀粉和糊精，这就要在测定前将淀粉，糊精去掉，这样就使操作复杂化，限制了其广泛应用。

（一）铁氰化钾法
1.原理：样品中原有的和水解后产生的转化糖都具有还原性质，在碱性溶液中能将铁氰化钾还原，根据铁氰化钾的
浓度和检验滴定量可计算出含糖量。

其反应为下：
C6H12O6+6K3[Fe(CN)6] + 6KOH →(CHOH)4•(COOH)2 + 6K4［Fe(CN)6］+ 4H2O
滴定终了时，稍过量的转化糖即将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体。

2，试剂
1）1％的次甲基兰指示剂
2)盐酸（水解作用）
3）10％和30％的NaOH溶液
4）1％铁氰化钾（贮存特色瓶，临用前标定）
标定步骤
称蔗糖1.0000g→定容500ml→取此液50ml→于100ml容量瓶→加hcl5ml→摇匀→65-70℃水裕15分钟→取出冷却→用30％NaOH中和→加水于刻度→倒入滴定管中→取10ml1％铁氰化钾于锥形瓶中→加10％NaOH2.5ml加12.5ml的水加玻璃珠颗粒→加热至沸→保持一分钟→加次甲基兰1滴→立即以糖液滴足至蓝色退去为止，记录用量。

正式滴定比较滴定时少0.5ml糖液，煮沸1分钟，加指示剂一滴，再用糖液滴定至兰色褪去，计算铁氰化钾溶液的浓度。

A=(W•V)/(1000×0.95)
A：相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的量（克）
V：滴定时消耗的糖液的体积
W：称取纯蔗糖的量
1000：稀释比
0.95：换算等数
3．操作方法
稀释10g→用100ml水作溶液→于250ml容量瓶→加20％醋酸铅10ml→至沉淀完为止→加10ml10％NA2HPO4→至不在产生沉淀为止→加水至刻度→过滤－取滤液50ml→于100ml容量瓶中→按铁氰化钾标定法进行转化，中和及滴定
计算糖含量
总糖（以转化糖计%）= (A ×1000)/(W•V)×100
A：相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的重量，
W：样品的重量
V：滴定时样液消耗的体积
4．实验应注意
（a）达终点时，过量的转化糖将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体，隐色体容量受空气中氧所氧化，很快又变
成指示剂的颜色。

（b）整个过程应在低温电炉上进行，滴定要速度，否则终点不明显
（c）糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓度
成正比，单、双糖等糖类都直接于试剂发生作用，因此不需要水解。

（二）蒽铜的比色法
1.原理：糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓
度成正比，可比色定量。

2.试剂
（1）硫酸锌溶液：溶解500g化学纯硫酸锌于500ml水中
（2）亚铁氰化钾溶液：溶解10.6g化学纯亚铁氰化钾于100ml水中
（3）0.2％蒽铜试剂：溶解蒽铜0.2g于100ml95％硫酸中，置棕色瓶中冷暗处保存
（4）0.1％葡萄糖液：准确称干燥葡萄糖0.1000g 定容100ml
3.操作方法
（1）标准曲线绘制
（2）100ml容量瓶编号
沸水浴加热6分钟，取出冷却→用1cm比色杯→610nm测定吸光度→作出以吸光度为横坐标，糖液浓度为纵坐标的准
曲线
（3）样品测定
称10g样品→于100ml热水加入500ml容量瓶中－加硫酸锌5ml→沸水浴5分钟→取出再摇动下加亚铁氰化钾5ml，→冷却→定容500ml→过滤→吸滤液25ml→于250ml容量瓶→定容250ml→取稀释液1ml，于比色管中→加10ml 蒽铜试剂→摇匀→水浴加热6分钟→冷却→比色
试验注意
1，样液必须清澈透明，加热后不应有蛋白质沉淀
2，样品颜色较深时，可用活性炭脱色后再进行测定
3，此法与所用的硫酸浓度和加热时间有关
4，所取糖液浓度在1-2.5mg/100ml之间
二. 还原糖的测定方法
还原糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖，在葡萄糖分子中含有淤青的醛茎，在果糖分子中含有淤青的酮茎，在乳糖中和麦芽糖中含有淤青的半缩羧茎，因此都有还原性。

在测定还原糖时一般测定总糖时所有将糖类水解为转化糖再测定的方法都可用来测定还原糖。

（一）斐林氏容量法
1.此法的原理、试剂、方法与总糖的测定方法相同。

只是样品溶液不必以过转化，而是直接取滤液进行滴定，滤液进行滴定，滤液中的还原糖含量以在0.2-0.5%为好，又能通过增减样品量或改变稀释倍数来调节。

10毫升费林氏A、B 液混合时理论上相当还原糖量如下：
葡萄糖（无水）果糖或转化糖尿病 0.0500克
乳糖尿病 0.0678克
麦芽糖 0.0807克
2试剂
（1）斐林氏A液，称69.8g cp硫酸铜于100ml水中，过滤备用
（2）斐林氏B液，称34.6g.cp浓流锌钠和100gcp NaOH于1000ml水中，过滤备用
3方法
称取样品10-20g：制备与转化同铁氰化钾法。

将样液倒入滴管中，吸取A,B液准备预滴定
预滴定：
吸A、B液各5ml→从滴管中加15ml样液→加热至沸→继续滴加样液→至兰色变潜→加3滴次甲基兰→在1分钟内滴定到终点
达到终点时，稍微过量的转化糖，将兰色的次甲基兰染色体还原为无色的隐色体，而显出氧化亚铜的红色，去碱性条
件下加热糖的产物是复杂的。

去碱性中断裂是由于碱度不同，加热时间不同，生产不等的碎片，这种碎片给后面滴定带来误差，而且，这种碎片与糖没有化合量的关系，所以，Lanecrol-Eynon Method 作出数据检索表
正式滴定：
吸A,B液各5ml→于三角瓶→加比预定量少0.5-1.0ml样液→2分钟内要求沸腾1分钟→加3滴指示剂→用样液滴定兰色消失
总沸腾时间为3分钟，即滴定在3分钟完成。

计算：
还原糖＝( F•V2)/(W•V1)×100
F：转还糖回数，即与10ml斐林氏试液相当的转化糖毫克数，
V1：样品试液总体积
V2：样品试液滴定量
W：样品重量
在测量乳糖制品时，若蔗糖与乳糖的含量比超过3：1时，则应与滴定量中加上相关表中（课本中表9-8）校正值后在进行计算
我们举例如下：
如果标准果糖溶液度为每100ml溶液含糖262.5mg。

对于10ml斐林试液从9-5可以查得果糖液滴定应为20ml。

如果不是20ml，可先算出A,B液校正等数。

然后进行计算
再如标准糖溶液浓度为每100ml溶液含糖199.3ml，对于10ml A,B液从9-4中查到，糖液滴定量应为25.00ml，若有出入可校正。

如果要求不高，可省略校正步骤但要求1％得测定误差，则省略校正。

另外有时候并未根据检索表计算样含糖量，但对A,B液进行标定，以使确定相当得还原糖量。

这种误差为0.5％。

下面我们讲标定量A,B液
准确准确称取烘干冷却得A.R蔗糖1.5g→用水溶解称取250ml容量瓶中→定容→吸50ml于100ml 定量瓶中→加HCL5ml→再65-70摄氏度水裕15分钟→冷却→用30％NaOH中和→定容
准确吸A,B液各5ml于三角瓶中→加水约50ml玻璃珠三粒→加热至沸→保持1分钟→加指示剂1滴→再煮1分钟
→立即用糖液滴定至兰色褪去，红色出现即为终点
正式滴定，先加入比预滴定时少0.5ml左右得糖液煮沸1分钟→加指示剂1滴→再煮沸1分钟→继续滴至终点
计算：A＝W*V/500×0.95
A：相当于10ml斐林氏A、B液的转化糖的量
W：称取蔗糖的质量
V ：滴定蔗糖的量
500：稀释比
0.95：换算等数
最后计算：
总糖（还原糖测定时样品溶液的消耗体积应该与标定葡萄糖标液的消耗体积相近，通过测定了解样品浓度是否合适，浓度过大或过小应该加以调整，使测定时消耗样品溶液量在10毫升左右；二是通过测定可知道此溶液的大概消耗量，以便在正式的滴定时，预先加入比实际用量少1毫升左右的样液，只留下1ml左右的样液在续滴定时加入，以便保证在1分钟内完成续滴定工作，提交预测定的准确度。

2.此实验影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度，煮沸时间和滴定速度一般煮沸时间短消耗糖多，反之，消耗糖液少，滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。

另外溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快，因此必须严格控制反应的体积）以转化糖计%=（A*1000/W*V）*100
A：同上
W：制取样品的量
V：滴定是时样品消耗量
1000：是稀释倍数（100/50*500）
1.预测定的目的：对样品溶液中还原糖浓度有一定要要求（0.1%左右），，使反应体系碱度一致。

热源一般采用800W 电炉，反应液在2秒内沸腾。

（二）KMNO4（高锰酸钾法）
1．原理，还原糖在碱性溶液中使铜盐还原成氧化亚铜，在酸性条件下，氧化亚铜能使硫酸铁还原为硫酸亚铁，再用
KMNO4溶液滴定硫酸亚铁，即可标出还原糖的量。

2. 操作方法
（1）样品处理
a. 乳糖：包括乳制品以及含蛋白质的冷食类
称样2-5g（液体样25~50ml）→于250ml容量瓶→加水50ml→加A液10ml+1N NaOH 4ml →定容→静置30秒→过滤→弃去初液→可测还原糖及蔗糖用。

b. 低酒度饮料：麦精露、各类汽酒等饮料。

先暴气除CO2→取100ml→于蒸发皿中→用1 N NaOH 中和→沸水浴蒸至原体积四分之→转入250ml容量瓶→加50ml水→摇匀→（加A液10ml→加1 N NaOH 4ml）→加水至刻度→静置30秒→过滤。

c. 含多量淀粉的食品：婴儿食品、糕干粉、宝宝乐、代乳粉、饼干、面包、糕点等
称样10-20g→250ml容量瓶→加水200ml→45度水浴加热1小时→不停摇动→冷后加水至刻度→静置→吸出清夜200ml于另一容量瓶（250ml）→加A液10ml+1N NaOH 4ml→静置30秒→过滤。

d. 汽水、果露、国产七种可乐及可口可乐
处理CO2→吸样液100ml→于250ml容量瓶→加水至刻度→可测还原糖及蔗糖。

（2）测定方法
取50ml处理的样液→于400ml烧杯→加A、B液各25ml→加热在4min左右沸腾→再煮2min→趁热抽滤→用60℃水洗烧杯和沉淀→直到洗液不成碱性→将抽滤的纸（或者石棉）及Cu2O→转入原来烧杯→用25ml硫酸铁溶液冲洗抽滤瓶→使冲洗液全部洗入原烧杯中→加水25ml→使Cu2O溶解→用0.1N KMnO4标液滴定至微红色，同时用50ml 水按上述方法做空白实验。

（3）计算
3. 注意事项：
（1）煮沸后的溶液显红色不显兰色，则表示糖量高，可减少取样体积。

（2）在洗涤Cu2O的整个过程中应使沉淀上层保持一层水层，以隔绝空气，避免Cu2O被空气中的氧所氧化。

（3）此法适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液不受限制，准确度高，重现性好。

准确性和重现性都优于直接滴
定法，但操作复杂、费时，需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表。

（二）直接滴定法（斐林氏溶液法）
1. 原理
样品经过处理除去蛋白质等杂质后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，用直接滴定法测定水解后
样品中的还原糖总量。

2. 试剂
3. 方法
（1）取过量样品进行提取，放入250ml容量瓶，加5ml醋酸锌和5ML亚铁氰化锌，定容，静止30分后过滤，滤液备用。

（2）测定
样品预滴定：
取A、B液各5ml于三角瓶中加水10ml，玻璃珠数粒，加热在2分内沸腾，趁热滴定，滴定到兰色褪去，记录用量。

正式滴定：
取A、B液各5mL于三角瓶→加玻璃珠三粒→从滴定管直接加比预滴定时少0.5-1.0ML样液，在2分沸腾，趁热滴定兰
色褪去，记录，取三次平均值计算结果。

三．蔗糖的测定
1．原理：样品除蛋白质后，其中的蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，用还原糖的测定方法，确定样品中蔗糖的含
量。

实际上测定还原糖包括两部分：一是样品中原有的还原糖、二是蔗糖经酸水解后的还原糖。

2．方法
吸还原糖样品处理稀释液50mL→于100ML容量瓶→加→于68-70度水浴上15分→冷却→加甲基红2滴→中和→定容→
取此溶液按还原糖的测定方法测定。

2．计算
蔗糖%=F(100/V2-100/V1) /(W╳50/250╳1000)╳100╳0.95
式中：F：10ml斐林氏试液相当于转化糖的质量mg。

V1：测定时消耗未经水解的样品稀释体积ml
V2：测定时消耗经过水解的样品稀释体积ml
w：原测定还原糖时样品的重量(G)
1000：将毫升换算成克
0.95：分子的蔗糖经水解后成为2分子的还原糖(一分子的葡萄糖和一分子的果糖)蔗糖的分子量为342,后来成为2×180.则342/360=0.95.所以转化糖换算到蔗糖应乘以0.95.
四.纸上层析法.
在食品中,糖的组分较为复杂,在淀粉糖浆中含有麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖等多种组分.对于这些食品中的各种组分,不可能用化学分析方法进行测定,而用物理分析方法进行测定.
纸层析应用于糖类的分离分析,它利用混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同速度移动而达到分离.
比移值Rf==组分展开的距离/溶剂展开的距离
糖的RF值的规律为:
单糖>双糖>三糖
戊糖>己糖
酮糖>醛糖
实验室常用的展开剂:
正丁醇:HAc:H2O==4:1:5
常用的显色剂:
0.1N AgNO3:NH4OH(SN)=1:1(灵敏度高，但斑点易扩散)
AgNO3/丙酮:NaOH/乙醇=1:1(克服上面缺点)
（显色剂书上给出许多,同学们可以自己看）
样品的处理可采用常规法如:糖的提取和蛋白质的除去可看前面讲的。

根据Rf值可求出各种糖的Rf与标准样品的Rf值进行比较,可确定出糖的种类,也可进行定量,用斑点光密度定量法直接在滤纸上测定.用斑点面积校正进行定量
凯氏定氮
样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH + 3H2SO4® 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4® (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4+ 2NaOH ® 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

【器材和试剂】
(一）器材
1. 100ml凯氏烧瓶
2. 改进型凯氏定氮仪
3. 50ml容量瓶
4. 分析天平（电子天平）
5. 烘箱
6. 电炉
7. 酒精灯
8. 小玻璃珠
9. 滴定管
10. 洗瓶
11. 锥形瓶
12. 铁架台
13. 普通面粉或其它样品
（二）试剂
1. 消化液
30% H2O2∶浓H2SO4∶H2O=3∶2∶1
2. 30% NaOH溶液
3. 2% H3BO3溶液
4. 混合催化剂（粉末K2SO4- CuSO4混合物）K2SO4与CuSO4以3∶1比例充分研细混匀。

5. 0.01mol/L标准盐酸溶液
6. 混合指示剂（田氏指氏剂）取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。

该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄（pH5.2～5.6）且很灵敏。

7. 蒸馏水
【实验步骤】
（一）改进凯氏定氮仪的构造和安装
改进型凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室及冷凝器三部分组成。

蒸馏装置的结构如图所示，可分成三部分来叙述：
1. 蒸汽发生器和反应室：蒸汽发生器有3个开口（图中的3、4、5）；反应室有1个开口(图中的6)。

2. 冷凝器和通气室：冷凝器有2个开口（图中的9、10）；通气室有2个开口（图中的12、13）。

3. 排水柱：排水柱有3个开口（图中的15、16、17）。

安装时，按图的连接方式仔细安装在一平稳的实验台上。

先将主体部分固定在铁架台上，其底部放上电炉或酒精灯。

然后将5与13；4与16；12与15；6与7用橡皮管连接，并夹上自由夹。

最后长橡胶管连接进水口10和出水口17。

（二）样品处理
样品若是液体，如血清、稀释蛋清等，可取一定体积直接消化测定。

若是固体样品，一般是用100g该物质（干重）中所含氮的g数来表示（%）。

因此在消化前，应先将固体样品中的水分除掉。

一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。

取一定量磨细的样品放入已称重的称量瓶内，然后置于105℃的烘箱内持续干燥4h。

用坩埚钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重。

按上述操作继续烘干样品，每干燥1h重复称量一次，直至两次称量数值不变，即达到恒重。

精确称量已达恒重的面粉0.1g，作为本实验的样品。

（三）消化
1.编号
取清洁干燥100 ml凯氏烧瓶4个，标号后各加数粒玻璃珠。

2.加样
在1、2号瓶中各加样品0.1g，混合催化剂0.2g，消化液5ml。

注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。

在3及4号瓶中各加蒸馏水0.1 ml代替样品，其它试剂同样品瓶，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。

3.加热消化
每个瓶口放一漏斗，在通风橱内，于电炉上加热消化。

开始消化时应以微火加热，不要使液体冲到瓶颈或冲出瓶外，
否则将严重影响测定结果。

待瓶内水汽蒸完，H2SO4开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，使瓶内液体微微沸腾而不致跳荡。

继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。

4.定容
消化完毕，静置，待烧瓶中液体冷却后，缓慢沿瓶壁加蒸馏水10ml，随加随摇。

冷却后将瓶内液体倾入50ml的容量瓶中，并以少量蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，并加水稀释到刻度，混匀备用。

（四）蒸馏
1.蒸馏器的洗涤
（1）接通冷凝水，打开自由夹②先向蒸汽发生器中加入一定量的水（以排水管的高度为宜），并关闭自由夹②，用酒精灯将其加热烧开。

（2）将蒸馏水由加样漏斗加入反应室，关闭自由夹①，移开酒精灯片刻，可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗3～5次。

（3）清洗后在冷凝管下端放一盛有5ml 2% H3BO3溶液和1～2滴指示剂混合液的锥形瓶。

蒸馏数min后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。

2.蒸馏
（1）取50ml锥形瓶3个，各加入2% H3BO3溶液5 ml和指示剂1～2滴，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。

（2）关闭冷凝水，打开自由夹②，使蒸汽发生器与大气相通。

将上述已加试剂的锥形瓶放在冷凝器下面，并使冷凝器下端浸没在液体内。

（3）用移液管取消化液5 ml，打开自由夹①，细心地从加样漏斗下端加入反应室，随后加入30%NaOH溶液5 ml，关闭自由夹①；在加样漏斗中加少量水做水封，以防止气体从漏斗处逸出。

（4）关闭自由夹②，打开冷凝水（注意不要过快过猛，以免水溢出）。

当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时（约2～3min），开始计时，蒸馏3min，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1㎝，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1min，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。

（5）蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前述。

打开自由夹③，将水放出，再加热，再清洗，如此3～5次。

最后将自由夹①、③同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉。

关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数min后，继续下
一次蒸馏。

待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。

3.滴定
全部蒸馏完毕后，用0.01mol/L标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的NH3，滴定终点为H3BO3指示剂溶液由绿变为淡紫色。

4. 计算
样品中总氮量可按如下公式计算：
式中：
c：为标准盐酸溶液摩尔浓度；
V1：为滴定样品用去的标准盐酸溶液的平均体积（ml）；
V2：为滴定空白消化液用去的标准盐酸溶液的平均体积（ml）；
W：为样品质量（g）；
14：为氮的相对原子质量。

若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25
若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。

蛋白氮= 总氮- 非蛋白氮
蛋白质含量（g %）= 蛋白氮×6.25
【要点提示】
1. 本实验时间较长，需要8～10学时。

所以做该实验时，建议分为2次完成。

第1次完成步骤（三）消化，该步骤所需时间较长；第2次从步骤（四）蒸馏做起。

2. 一般样品消化终点为溶液呈透明淡绿色或无色透明，若带有黄色表示消化不完全；另一方面，消化液的颜色亦常因样品成分的不同而异。

因此，每测一新样品时，最好先试验一下需多少时间才能使样品中的有机氮全部变成无机氮，
以后即以此时间为标准。

本实验到消化液呈透明淡绿色时即消化完全，消化时间过长，会引起氨的损失，同样影响测定结果。

3.如果蛋白质样品中含赖氨酸或组氨酸（如蚕蛹蛋白质）较多，则消化时间要延长1～2倍；为了缩短消化时间，可在催化剂中再加少量HgCl2(约0.032g/g催化剂)，则赖氨酸中的氮4～5h可消化完全，组氨酸约需8h左右才能消化完全。

4. NH3蒸馏时，为了使所有(NH4)2SO4都分解放出NH3，必须加入足量的30%NaOH。

加入时应缓慢，碱加入后，有Cu(NH3)2+、Cu(OH)2或CuO等化合物生成，溶液呈蓝色或褐色，并有胶状沉淀产生，这是正常现象，反之如果颜色不变，说明碱液可能不够。