动物类中药提取方法

动物类中药提取方法

我国应用动物药历史悠久。远在4000年前甲骨文中就记载了蛇、麝、犀牛等40余种药用动物，最早的本草专著《神农本草经》中收载了僵蚕、地龙等动物药67种，对其应用及疗效亦有明确记载。《本草纲目》中动物药增至440种。近代《中国药用动物志》更是收载动物药多达1581种，临床各科广为使用。

动物药是中药的重要组成部分,近十年来,动物药的临床和药理研究日益受重视,而且在活性成分的研究方面也获得迅速发展。但由于动物药化学成分复杂，大多为大分子化合物，分离分析难度较植物药大，与植物药活性成分的研究相比已远远落后。然而，由于其生物活性强、临床疗效高、含量丰富等特点又激励人们不懈地去探索动物药的药效物质基础和开发利用前景。

经研究表明，动物药中的化学成分包括蛋白质、多肽及氨基酸类、生物碱类、多糖类、甾体类、萜类、酚、酮、酸类等多种化学成分。因此对于动物药的提取，可根据不同成分的性质，采用不同的提取方法。

1 蛋白质、多肽及氨基酸类提取

氨基酸、多肽、蛋白质广泛存在于动物类中药,是动物药中普遍存在的化合物,这些成分以往常被认为无药理作用,属于无效成分或有毒成分。近年来的研究得知,许多蛋白质和多肽是动物药中的有效成分,动物药中的蛋白质和多肽成分研究也渐被人们重视。

大部分蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。另外，每个氨基酸都有其固有化学特性，导致不同的多肽因其组成不同而具有不同的溶解性。因此对于不同的蛋白质、多肽及氨基酸的可采用不同溶剂提取、分离及纯化。

蛋白质的提取一般常采用各种水溶液，为防止原料中可能存在的酸或碱的影响，常用pH缓冲液提取。蛋白质氨基酸的提取一般是将蛋白质经酸、碱或酶水解后，分离得到各种氨基酸；天然游离的氨基酸的常采用水或稀醇等极性溶剂进行提取。为了尽可能的提取完全，常需要对一些动物药进行细胞破碎，使其蛋白质、多肽及氨基酸释放出来进入提取溶剂中，以达到的提取的目的。同时，有些活性蛋白，为避免其变性失活在细胞破碎过程中应注意控制条件。在实验室内常用的破碎方法有：

1.1物理方法

1.1.1机械方法

主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。

a 高速珠磨法

高速珠磨法是很有效的破碎方法，少量样品可以在聚乙烯试管内进行，较多的样品需高速珠磨机。对于一些活性蛋白，珠磨机的搅拌速度须限制在合时的范围内以减少产生的热量，避免造成蛋白质的失活。对于破碎对象，最好先预冷后再进行细胞破碎，玻璃珠在使用前，通常也需清洗和预冷却。

b 高压匀浆法

高压匀浆过程中，细胞受到剪切、碰撞、压力骤变等作用而被破碎，释放出目的蛋白，这是一种常用的破碎方法。对于细胞膜结合的蛋白质，一般需要多次破碎。活性蛋白的提取，操作应尽可能在低温下进行，以免因为产生太多的热量而导致目的蛋白的失活

1.1.2 非机械方法

通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

a 冻融法

于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。根据纤维蛋白原在低温下可形成絮状沉淀的性质，有人采用冻融法即先将抗凝血浆在- 20 ℃温度下冷冻12 h , 再经4 ℃解冻, 低温离心收集纤维蛋白原样品的方法，从猪血中提取纤维蛋白原[1]。

b 冷热变替法

将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。

c 超声波法

暴露于9～10千周声波或10～500千周超声波所产生的机械振动。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。超声波破碎在实验室规模应用较普遍, 处理少量样品时操作简便, 液量损失

少, 但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活[2]。

1.2化学及生物化学方法

1.2.1 有机溶媒法

粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。

1.2.2 酶解法

酶解法是利用酶的作用将动植物细胞壁或细胞膜或对某些成分水解或降解，使有效成分充分地暴露出来，溶解、混悬、胶溶于溶剂中，以提高活性成分的提取率，同时，生物酶作用于药材中的某些成分发生降解、水解，生成可被吸收入血的药效物质。据报道，酶解法在食品工业、海洋生物制药和药物有效部位提取方面已显示出较好的应用前景。蛋白酶可分为酸性、中性和碱性三种。酸性蛋白酶的最适pH 为2~2.5；碱性蛋白酶的最适pH 为11,反应条件剧烈, 对设备的要求较高且水解度不容易控制, 在生产中不具有实际意义。而中性蛋白酶主要从蛋白质内部将肽键打开, 专一性突出, 反应条件温和(pH7), 水解效力适中，操作易于控制。常用的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、Protamex、Alcalase 214L、Trypsin、木瓜蛋白、中性蛋白、Flavourzyme、Kojizyme等。

酶解法专一性强，收率高，只需要选择合适的酶及反应条件，就可有效地进行细胞的破碎。使用酶解法需要先试验，以确定合适的酶解温度、pH及酶用量。

付学军等[3]利用A.S1398 精制中性蛋白酶对海参进行酶解然后经过醇沉，超滤等过程制得海参多肽，并且优选了最佳酶解条件为：加6倍量的水、1.0%蛋白酶，30℃下水解6h。在该条件下海参多肽得率为12.0%。

2 其他类成分的提取

动物药所含生物碱有多种类型，且大多为衍生物。如河豚中毒性极强，有松弛肌肉痉挛、减轻晚期癌痛的作用的河豚毒素[4]，属胍类衍生物；动物胆汁中有促进红细胞新生、血清抗炎、治疗肝硬变作用的胆红素属吡咯衍生物；蟾蜍色胺属吲哚类生物碱。动物药中的生物碱类成分，常根据不同的溶解性，选用不同的溶剂进行提取。可溶性生物碱可选用水或酸水提取，然后再采用阳离子树脂交换法或萃取法进行纯化和富集。如宫庆礼[5]等从河豚鱼肝脏提取河豚毒素，将河豚