第三章 动物细胞工程制药45节_PPT幻灯片
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（6）及时分种，保持合适的细胞密度
细胞培养的无菌操作 二氧化碳细胞培养箱
1、器材的清洗和消毒
器材的清洗：一般来说，需经浸泡、刷洗、泡 酸和冲洗四个步骤，用过的器材最好尽快地浸 泡在3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白 质和残余细胞等污垢
经常使用的玻璃器材不一定每次刷洗完之后都 要泡酸，但新买的玻璃器材在使用前必须泡酸 （配比表见表3-3）。器材刷洗或清洁液浸泡 后都必须用水充分冲洗，再用蒸馏水和无离子 水冲洗
动物细胞
10-100μm 内部和激素
苛刻
倍增时间一般为12-60h 很差，缺乏保护性细胞壁
差
微生物和动物细胞培养方法的比较
PH控制 搅拌速度 溶氧控制 培养基灭菌方法 培养时间 对水纯度的要求
微生物细胞
添加酸、碱 速度快、范围广 改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度
高温蒸煮 几小时—几天
较低
动物细胞
CO2-HCO3缓冲液 较慢
蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独 使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低， 电阻值在18M以上。动物细胞制药用水，要求去热源
一、动物细胞的培养条件
3、pH pH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透
性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细 胞培养的最适pH为7.2~7.4，低于6.8或高于7.6时 会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变 甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对 pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时 耐受性强。细胞代谢也会造成pH变化，可用缓 冲体系来稳定细胞周围环境的pH。书中给出了 部分缓冲体系，可以参考
细胞种类不同，培养温度要求有所不同
动物细胞特别是哺乳动物细胞的最佳培养温度为 （37±0.5℃），昆虫细胞则为27 ℃
温度过高可引起细胞衰退甚至死亡，过低则会降 低其代谢和生长速度，影响产物的产量
一、动物细胞的培养条件
6、空气 空气也是细胞赖以生存的必要条件之一。尽管细
胞在短时期缺氧时可以通过糖酵解途径进行代谢 获取能量，但该代谢是不完全的，获得的能力也 是有限的，而且还会大量产生乳酸，使pH 值急剧 下降，最终引起小的退变和死亡。因此在细胞培 养中必须给以足够的氧气 对于动物细胞来说，它在体内的生存条件一般都 低于空气中氧的饱和值的60%，对氧的消耗为 0.006～0.3μmol/106细胞·h-1或0.24mg/106细胞·d-1
改变进入气体的氧浓度 过滤
几天—3、4周 很高
与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴
壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类 是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。
一、动物细胞的培养条件
4、渗透压 由于动物细胞缺乏细胞壁，因此外界环境渗透压
的高低波动对细胞的存活有很大的影响 不同的细胞对渗透压波动的耐受性不同，比如 原
代细胞 较 传代细胞敏感 通常最理想的渗透压为 290～300 mOsm/kg，
调整渗透压采用的是加减 NaCl 的办法。每增加 或减少 1mg/mL的NaCl 可使培养基的渗透压增 加或减少 32 mOsm/kg
器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学 方法来达到严格无菌的操作过程。书中表34是细胞培养中常用的消毒剂、浓度和使用
场合的列表。尽量避免使用抗生素，但在 工业生产中还是经常使用的。
对以在细胞培养中是否可以采用抗生素，说法不 一
多数人认为采用抗生素弊大于利，因为细菌很快 会产生抗药性，以后就很难消除，同时又有人证 明，长期使用抗生素，可影响细胞的生理代谢和 形态，还会影响细胞内的一些信号通路
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本 条件：
（1）绝对无菌操作：所有与细胞接触的设备、 器材和溶液，都必须保证无菌，避免细胞外微生 物的污染
（2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其 微量的离子掺入
（3）适量氧气供应
（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物
（5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透 压和离子浓度等
6、空气
一般采用方瓶或转瓶培养时，只要我们保持瓶内 有足够的空间，即培养液体积不超过总体积的 30%，通过液面的空气交换，就可以保证细胞有 足够的氧，不需要专门通气 。但采用生物反应器 大规模培养时，则必须专门通气，补充氧量
过高的氧对细胞生长也会产生不利的影响，甚至 是有毒的。 生产中常采用不同比例的O2,N2,CO2和空气， 根据需要加以使用
微生物细胞与动物细胞培养方法的比较
所谓动物细胞培养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成
单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体 外继续生长和繁殖
性质
大小 代谢调节方式
营养要求
生长速率 机械强度 环境适应
பைடு நூலகம்微生物细胞
1-10μm 内部
宽松，可利用多种底物
倍增时间一般为0.5-2h 较好 好
在实际操作中，尤其是在大规模生产中，为了尽 可能避免污染，造成经济损失，有人仍主张采用 抗生素，而且用量差别很大，常用抗生素及其浓 度见表3-5
按规定在生产中不准使用青霉素和β-内酰胺类 （革兰式阳性细菌）抗生素，其他抗生素是可以 接受的，非生产性的实验不受此规定
实验室中常加的是青霉素和链霉素，简称双抗， 防细胞污染
4、渗透压
在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的 所有液体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都 需要使用平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）， 它由无机盐和葡萄糖组成。表5-6列出了几种常用 平衡盐溶液（BSS）组成/g·L-1。
一、动物细胞的培养条件
5、温度 温度对微生物和动植物细胞的培养都很重要，但
污染最多的是霉菌和真菌
培养器皿
动物细胞培养瓶内表面为什么 要光滑、无毒？
多孔板
细胞培养瓶
一、动物细胞的培养条件
2、水质 动物细胞培养对环境中各种因素非常敏感，因此水质的好
坏直接影响培养的成功与否
微量的有毒元素、过多的金属离子，以及微生物的污染等， 都会危害细胞的生长。因此细胞培养的用水必须进行特殊 的处理才能使用
细胞培养的无菌操作 二氧化碳细胞培养箱
1、器材的清洗和消毒
器材的清洗：一般来说，需经浸泡、刷洗、泡 酸和冲洗四个步骤，用过的器材最好尽快地浸 泡在3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白 质和残余细胞等污垢
经常使用的玻璃器材不一定每次刷洗完之后都 要泡酸，但新买的玻璃器材在使用前必须泡酸 （配比表见表3-3）。器材刷洗或清洁液浸泡 后都必须用水充分冲洗，再用蒸馏水和无离子 水冲洗
动物细胞
10-100μm 内部和激素
苛刻
倍增时间一般为12-60h 很差，缺乏保护性细胞壁
差
微生物和动物细胞培养方法的比较
PH控制 搅拌速度 溶氧控制 培养基灭菌方法 培养时间 对水纯度的要求
微生物细胞
添加酸、碱 速度快、范围广 改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度
高温蒸煮 几小时—几天
较低
动物细胞
CO2-HCO3缓冲液 较慢
蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独 使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低， 电阻值在18M以上。动物细胞制药用水，要求去热源
一、动物细胞的培养条件
3、pH pH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透
性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细 胞培养的最适pH为7.2~7.4，低于6.8或高于7.6时 会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变 甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对 pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时 耐受性强。细胞代谢也会造成pH变化，可用缓 冲体系来稳定细胞周围环境的pH。书中给出了 部分缓冲体系，可以参考
细胞种类不同，培养温度要求有所不同
动物细胞特别是哺乳动物细胞的最佳培养温度为 （37±0.5℃），昆虫细胞则为27 ℃
温度过高可引起细胞衰退甚至死亡，过低则会降 低其代谢和生长速度，影响产物的产量
一、动物细胞的培养条件
6、空气 空气也是细胞赖以生存的必要条件之一。尽管细
胞在短时期缺氧时可以通过糖酵解途径进行代谢 获取能量，但该代谢是不完全的，获得的能力也 是有限的，而且还会大量产生乳酸，使pH 值急剧 下降，最终引起小的退变和死亡。因此在细胞培 养中必须给以足够的氧气 对于动物细胞来说，它在体内的生存条件一般都 低于空气中氧的饱和值的60%，对氧的消耗为 0.006～0.3μmol/106细胞·h-1或0.24mg/106细胞·d-1
改变进入气体的氧浓度 过滤
几天—3、4周 很高
与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴
壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类 是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。
一、动物细胞的培养条件
4、渗透压 由于动物细胞缺乏细胞壁，因此外界环境渗透压
的高低波动对细胞的存活有很大的影响 不同的细胞对渗透压波动的耐受性不同，比如 原
代细胞 较 传代细胞敏感 通常最理想的渗透压为 290～300 mOsm/kg，
调整渗透压采用的是加减 NaCl 的办法。每增加 或减少 1mg/mL的NaCl 可使培养基的渗透压增 加或减少 32 mOsm/kg
器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学 方法来达到严格无菌的操作过程。书中表34是细胞培养中常用的消毒剂、浓度和使用
场合的列表。尽量避免使用抗生素，但在 工业生产中还是经常使用的。
对以在细胞培养中是否可以采用抗生素，说法不 一
多数人认为采用抗生素弊大于利，因为细菌很快 会产生抗药性，以后就很难消除，同时又有人证 明，长期使用抗生素，可影响细胞的生理代谢和 形态，还会影响细胞内的一些信号通路
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本 条件：
（1）绝对无菌操作：所有与细胞接触的设备、 器材和溶液，都必须保证无菌，避免细胞外微生 物的污染
（2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其 微量的离子掺入
（3）适量氧气供应
（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物
（5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透 压和离子浓度等
6、空气
一般采用方瓶或转瓶培养时，只要我们保持瓶内 有足够的空间，即培养液体积不超过总体积的 30%，通过液面的空气交换，就可以保证细胞有 足够的氧，不需要专门通气 。但采用生物反应器 大规模培养时，则必须专门通气，补充氧量
过高的氧对细胞生长也会产生不利的影响，甚至 是有毒的。 生产中常采用不同比例的O2,N2,CO2和空气， 根据需要加以使用
微生物细胞与动物细胞培养方法的比较
所谓动物细胞培养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成
单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体 外继续生长和繁殖
性质
大小 代谢调节方式
营养要求
生长速率 机械强度 环境适应
பைடு நூலகம்微生物细胞
1-10μm 内部
宽松，可利用多种底物
倍增时间一般为0.5-2h 较好 好
在实际操作中，尤其是在大规模生产中，为了尽 可能避免污染，造成经济损失，有人仍主张采用 抗生素，而且用量差别很大，常用抗生素及其浓 度见表3-5
按规定在生产中不准使用青霉素和β-内酰胺类 （革兰式阳性细菌）抗生素，其他抗生素是可以 接受的，非生产性的实验不受此规定
实验室中常加的是青霉素和链霉素，简称双抗， 防细胞污染
4、渗透压
在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的 所有液体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都 需要使用平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）， 它由无机盐和葡萄糖组成。表5-6列出了几种常用 平衡盐溶液（BSS）组成/g·L-1。
一、动物细胞的培养条件
5、温度 温度对微生物和动植物细胞的培养都很重要，但
污染最多的是霉菌和真菌
培养器皿
动物细胞培养瓶内表面为什么 要光滑、无毒？
多孔板
细胞培养瓶
一、动物细胞的培养条件
2、水质 动物细胞培养对环境中各种因素非常敏感，因此水质的好
坏直接影响培养的成功与否
微量的有毒元素、过多的金属离子，以及微生物的污染等， 都会危害细胞的生长。因此细胞培养的用水必须进行特殊 的处理才能使用