管碟法测定抗生素效价详解

一、试验前准备
• 双碟的挑选
内径约90mm，硬质玻璃或 塑料培养平皿，水平透明， 无色斑气泡
• 物品的清洗、灭菌
培养皿、钢管、刻度吸管清 洗后160℃干热灭菌2小时或 121℃高压蒸汽灭菌30min， 放置室温备用；陶瓷瓦盖要 定期清洗干燥。
牛津杯的挑选
内径（6.0±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm，外径 （7.8±0.1）mm，重量差异不超 过±0.01g，光洁平坦
10.毛细滴管或可调式移液器（1～1000μl) 11.天平 12.抑菌圈(直径)测量仪。 13.超净工作台 用于菌种的接种或传代。超净工作台须置
洁净工作室或半无菌室内。
检定菌的来源：检定菌种由中监所所提 供的冷冻干燥品。
检定菌的传代和接种： 芽胞杆菌3～6个月（其他细菌每个月） 用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物 代替原有的菌种，作为工作用（阳性对照）菌 种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要 求进行。
抗生素浓度换算成对 数，则抑菌圈直径与抗 生素对数成直线关系
2.原理－抑菌圈的形成
• 两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养 基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌 的生长作用。
• 当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种 互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中 便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因 抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受 到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑 菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低 抑菌浓度。
基本要点 ： ① 高剂量抗生素溶液所形成的抑 菌圈直径在18～22mm； ② 高、低剂量所形成的 抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差数可 较小； ③ 高、低剂量之比一般用2:1，当高、 低剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用高低剂量
之比为4:1的比率。
仪器与用具 1 . 操作室 2. 双碟 3. 陶瓦盖 4. 钢管 5. 钢管放置器 6. 恒温培养箱 7. 灭菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 称量瓶
效 价 （ ｐ otency ） ， 指 检 品 的 实 际 单位数与其标示量的比值。常表示为效价 的百分数。
单位（unit,u）单位是衡量抗生素有 效成分的具体尺度。
（１）重量单位 以抗生素的生物活性部分重量作 单位
１微克（ｕｇ）＝１单位，１毫克＝１０００单位。
（２）类似重量单位 以特定的纯粹抗生素盐类的 重量作为１单位。如纯粹金霉素盐酸盐及四环素 盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）１微克 （ｕｇ）＝１单位，１毫克＝１０００个单位。 这是根据国际使用习惯而来的。
冷冻菌种安瓶的接种。
•
用75%酒精棉擦净菌种安瓿的外壁，
稍干。 点燃酒精灯，将安瓿的封口，一端
在火焰上烧灼红热用毛细管吸取灭菌水少许
在灼热处，使其骤冷而炸裂，另取1支灭菌
毛细滴管，在火焰旁吸取少量灭菌水，加至
菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随
即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面，
将营养琼脂斜面琼脂斜面于37℃恒温培养24
抗生素微生物测定法
一、概述
1.抗生素的概念及抗生素的生物检定
抗生素是由微生物所产生的极微量便 具有选择性地杀死或抑制其他病原微生物 生长的一类天然有机化合物。
抗生素的生物检定是以抗生素对微生 物的抗菌效力作为效价的衡量标准。
2.抗生素的效价和单位
抗生素的含量用效价和单位表示。该 词有时不加区别统称为效价单位。
缓冲液的制备
• 磷酸盐缓冲液（pH6.0） 取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢 钾8g，加水使成1000ml，滤过。
• 磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钠 （Na2HPO4*12H2O）9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使 成1000ml，滤过。
• 磷酸盐缓冲液（pH7.8） 取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二 氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。
小时。
管碟法的操作步骤
预试验→试验准备→ 双碟底层的制备→ 供试品、标准品溶液的制备→菌层的制备 →滴加抗生素溶液→双碟的培养→ 抑菌圈 的测量→结果的可靠性检验及效价测定
• 预试验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、 使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所 致的抑菌圈直径在18～22mm。高剂量与 低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。
➢ 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的 抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。
• 试验准备：
双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭 菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、 缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
• 供试品、标准品溶液的制备：
估计供试品的效价，根据试验要求设计供 试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供 试品、标准品相关剂量的溶液。
（３）质量折算单位 以特定的纯抗生素盐的质量 为单位而加以折算。青霉素0.6ug为1单位
（４）特定单位 以特定的抗生素标准品的某一质 量定为一单位。
抗生素微生物检定法
• 管碟法 • 浊度法
1、管碟法：是利用抗生素在摊布特定试验 菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含有 一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁 殖而呈现出的透明抑菌圈。此法系根据抗生 素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈面 积呈线性关系，通过比较
1. 称量 称量前，将标准品从冰箱取出，使与温室平衡； 供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品 应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前1～2ｈ更换 天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取， 不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量 不可少于20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸 水。样品的称样量最好不少于50mg。
标准品与供试品产生抑菌
圈的大小，计算出供试品
的效价。
• 2、浊度法系利用抗生素在液体培养基中对 试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后 细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品 对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品 效价的一种方法。
管碟法测定抗生素效价 原理和方法
一、 原理 在一定的Hale Waihona Puke Baidu生素浓
度范围内，对数剂量(浓 度)与抑菌圈的表面积或 直径成正比，可以得出 一条曲线。