管碟法测定抗生素效价

时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新
滴加。抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈
黑色。（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量
也有差异。）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去
多余部分。
双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养,培养箱中 水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
流程图
半固体琼脂斜面 制菌悬液
冻干菌粉
营养肉汤
（复活）
穿刺管（保藏及传代用）
备注：每经过一次培养箱培养，菌的代数就增加一代。 参考：《药品微生物学检验技术》主编：苏德模 马绪荣 2007年出版
1.复活 从菌种保藏机构购回的标 准菌株，是冷冻干燥粉，需 经过复活。（冻干菌种为第0 代）
温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养
基均匀铺开。
放置小钢管 放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相 邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影 响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太
靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面
，会影响抑菌圈的形状。
22mm,三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈
直径在15～18mm.
高低剂量之比为2:1.
试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可
以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验 ，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌 液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过 久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的 敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯 ，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以 重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
• 当培养到一定时间，琼脂培养基的两种互动作用达到动态
平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌
圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制， 此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好 等于抗生素最低抑菌浓度。
量反应平行线原理：当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线 关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准 品的两条量-反应关系曲线相互平行。（中国药典二部附录XIV
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基本原理
2010版药典二部附录及2015版药典，在适宜条件下，根据量
反应平行线原理，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用， 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小 ，测定供试品的效价。
抑菌圈的形成 • 两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩
散作用；另一种是试验菌的生长作用。
滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱
的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于
桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。双碟在37℃下培养
约16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的
敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小
。在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造
革兰染色注意事项
1.革兰染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰阳性
菌也可被脱色而被误认为革兰阴性菌；如脱色时间过短，
革兰阴性菌也会被误认为是革兰阳性菌。因此必须严格把
握脱色时间。
2.选用培养18～24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于
菌体死亡或自溶常使革兰阳性菌转呈阴性菌。
革兰染色结果
革兰染色结果
试验准备：
双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量
吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒 等.
抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清 洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆
大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如
新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中
生物检定统计法）
菌液制备 根据中国药典2010年版二部附录要求，硫酸庆大霉素和硫酸
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庆大霉素颗粒测效价，选取短小芽孢杆菌作为试验菌。 取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]的营养琼脂斜面培养物，接 种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日 ，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水
成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。 所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟 叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影 响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。
革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml
洗下芽孢，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得。置
5℃冰箱中保存。
革兰染色法
• 具体操作步骤： • ⑴涂片 • ⑵干燥（自然干燥、培养箱内） • ⑶固定（火焰） • ⑷染色（包含初染、媒染、脱色、复染四步）
涂片
染色 初染：草酸铵结晶紫染1分钟，自来水冲洗。 媒染：加碘液覆盖涂面染1分钟，自来水冲洗。 脱色：加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒 后自来水冲洗。 复染：加沙黄（复红）复染液30秒后，自来水冲洗 。 自然干燥或用吸水纸吸去水分，镜检。 染色的结果：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红 色。
图片染色步骤
草酸 铵结 晶紫
盐 水 涂片
接 Hale Waihona Puke Baidu 环
自然干燥
固定
初染
1min
干燥 镜检 复染
30s
复 红
脱色 30s
95% 乙醇
媒染 1min
碘 液
革兰染色原理
• 由于细菌细胞壁的结构和组成不同，将细菌分为革兰阳性 菌和革兰阴性菌。 • ⑴G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性孔障， 当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，透性降低,故保留 结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保留在细胞膜上，菌体呈紫 色为革兰阳性菌。 • ⑵Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构 收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，细胞壁透性加大，结晶 紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后菌体呈红色为革兰阴 性菌。
在中国药典2010年版二部附录Ⅺ抗生素微生物检定法及 2015版药典中，详细描述了管碟法和浊度法测定抗生素 效价的方法，根据公司生产及检测情况，主要是硫酸庆 大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用抗生素管碟法测效价 来计算含量，因此，此章主要介绍管碟法。
抗菌活性
•抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。 •抗生素的抗菌活性通常用效价来表示。 •在临床应用中，抗生素的抗菌活性可准确地反应抗生素的医 疗价值。 如：硫酸链霉素 798单位/毫克 青霉素G钠 1670单位/毫克
造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用
流水冲洗。
双碟的制备： 每只双碟加底层培养基约
20ml,待培养基凝固后,将双碟
放入35～37℃培养箱中,待用.
无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会
影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给
试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板
基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培
养基吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不 易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。 因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管 5mL，湿热灭菌后放在50℃水浴锅内保温(水浴温度：细菌 为48~50℃，芽孢可至60℃)。试验中，再分别加入菌液混 匀，配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基
无菌操作，将冷冻干燥菌种安瓿用75%乙醇消毒后，用砂轮
在安瓿颈部刻线，用无菌纱布掰开，或灼热安瓿顶部，立即
作灭菌湿纱布盖住顶部，安瓿顶部便骤然裂开，小心移去玻 璃碎片，用一无菌毛细管吸取0.5-1ml适宜的液体培养基，直 插安瓿底部，挤出营养肉汤培养基，在底部振摇使菌粉溶解 ，再将安瓿内菌液吸出，接种至营养肉汤培养基。35-37度 培养18-24小时。（此为第一代）
小钢管放置时，要小心地从 同一高度垂直放在菌层培养 基上，不得下陷，不得倾斜 ，不能用悬空往下掉的方法 。放置之后，不能随意移动 ，要静置5min，使之在琼脂 内稍下沉降稳定后，再开始
滴加抗生素溶液。
滴加抗生素溶液：
注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序,保证滴加速度和加量的
均匀一致.
滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法）或者
SH→TH→SM→TM→SL→TL（三剂量法）的顺序滴加。滴加之前，
滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管的时候，由
于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，
继
续滴加容易造成气泡膨胀破裂，
使溶液溅落在琼脂培养基表面造
成破圈。因此一旦毛细管中出现
气泡或者残留，就重新吸取抗生
素溶液进行滴加，毛细管口应避 免太细，滴加的时候离开小钢管 口距离不要太高。
SL标品的低浓度
TH样品的高浓度
TL样品的低浓度
SH标品的高浓度
滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还 有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触， 有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此
制保藏用菌株
•将营养肉汤培养物，用接种针沾取菌苔（菌液），沿半固体
培养基中心向管底作直线穿刺。穿刺到保藏管中，同样温度
35-37度，培养18-24h，然后，放置2-8度冰箱保存，作为保
藏及传代用的菌株。
制工作用菌悬液
试验用菌种穿刺管1支，按无菌操作要求，接种于盛有30ml 普通琼脂培养基的大三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养 基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入消毒液中。 将已接种的三角瓶置35～37℃的培养箱中培养7～10天，用
典中仍占有重要地位。
1.微生物检定法可直观、特异的反应出抗生素药品 的抗菌活性，显示临床的特点。 2.多组分抗生素由于不同组分生物活性的差异，化
学测定结果难以准确表征组分、组成、含量和活性
的关系。
3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化
学分析方法表征其活性。 4.同时微生物法所需的仪器设备简单，成本低。
管碟法测定抗生素的效价
目录
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3 4 5 6
• 概述 • 基本原理 • 菌液制备
• 基本操作及注意事项
• 操作要点 • 检定的影响因素
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概述 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生
素效价测定方法。随着HPLC等化学分析技术的发展，
一些抗生素效价的测定已被化学方法所替代，但由
于以下原因，抗生素微生物检定法，目前在各国药
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基本操作及注意事项
管碟法的操作步骤
预试验 试验准备 双碟的制备 供试
品、
标准品溶液的制备 滴加抗生素溶 液 菌层的制备 双碟的培养 放置小钢管 抑菌圈的测量
结果的可 靠性检验及效价测定
预试验： 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗 生素浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定，即二 剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～
，保证双碟放置区域的平整。在双碟底部预先标记样品的高低浓度区
域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来
加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即
使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上
铺开，达到消除误差的目的。
试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或
者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平
面，会给试验带来误差。加注60～80℃的培养基底层之后，
不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的 水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层 上，会给培养基菌层的加注带来影响。
供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价,根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤, 平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液. 依公司产品，硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用的是二剂量法 ，试验中，制成高、低浓度的溶液。 依中国药典2010版及2015版二部附录要求，
菌层的制备： 注意菌层培养基温度； 根据预试验确定加入菌
层培养基的菌液量,注意
制备菌层的速度和平整 度.
制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长
都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤
为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50℃水
浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养