管碟法测定抗生素效价
管碟法测定抗生素效价详解
4．放置钢管 用钢管放置器，将干热灭菌的镊子或适宜方法将钢 管装于玻璃管中，放于钢管放置器上，将双碟打开，放入双碟台上， 托起双碟台，使钢管平稳落在培养基上，注意使各个钢管下落的高 度基本一致，钢管放妥后，双碟静置 5 ～10 min, 使钢管在琼脂内稍 下稳定后，再开始加抗生素溶液。 5．滴加抗生素溶液 每批供试品取6~10个双碟，滴加溶液可调式 移液器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。滴加溶液的顺 序:SH→TH→SL→TL。滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不 可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。
• 结果判断 • 1. 可靠性测验结果认为可靠，方可进行效价和可信限率计算。 • 2.可信限率 考核实验的精密度，除药典各论另有规定外，本法的 可信限率不得超过5%。上述各项规定都能符合者，试验结果成立。 • 3. 实验计算 所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的 110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。 • 4. 效价测定 一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符合规 定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。
• 结果的可靠性检验及效价测定： 抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结 果。
记录与计算 1. 试验记录 应包括抗生素的品种、剂型、标示量、 生产厂、批号、检查目的、检验依据、检验日期、温 度、湿度，标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对 人，抑菌圈测量结果。当用游标卡尺测量抑菌圈直径 时，应将测试数据以框图方式顺双碟数记录。当用测 量仪测量面积或直径时，应将电脑测试、计算、统计 分析的打印纸贴附于记录中。 2. 计算注意事项：a、浓度比不等于1.000时，如标准 品溶液（S）d的浓度为1005u/ml,而供试品溶液(T)的 浓度995u/ml，D=S/T=1.0101；也可将D值设为1.000， 而估计效价设为101.01% b、所测定的实际效价应在D值与估计效价乘积的90%和 110%范围内，超出就应重新估计效价。如估计效价为 100%，D=1.000，而测得的效价为115%，按110%重估效 价再进行试验。 C、原料及不合格供试品，进行平行试验，配置两份标准 品和两份供试品，一份标准品与一份供试品为一组滴 样
抗生素生物效价测定
实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
管碟法测定抗生素效价
管碟法测定抗生素效价
原理
抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相
一致、用量少和灵敏度高等优点。
管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，
作为法定的抗生素生物检定方法。
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度
高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑
制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌
圈直径的平方成线性关系。
实验步骤
1. 配制标准品溶液
2. 配制样品溶液
3. 制备菌悬液。
4. 制备平板：
（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。
（2）另取冷却至50?左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。
5. 在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。
6. 用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。
7. 将培养皿平稳送入恒温箱，37?下培养16～18h。
8. 用游标卡尺测量抑菌圈直径。
抗生素的生物效价测定法(管碟法)
抗生素的生物效价测定法(管碟法)work Information Technology Company.2020YEAR抗生素的生物效价测定法测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。
生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。
抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。
稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。
这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。
所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。
由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。
比浊法原理及操作大致与稀释法相同。
比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。
这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。
这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。
扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。
经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。
管碟法对抗生素药品效价的微生物检定
第9卷第3期延安大学学报（医学科学版）Vol.9No.3 2011年9月Journal of Yanan University（Med Sci）Sep.2011管碟法对抗生素药品效价的微生物检定王新霞1，宋雪玲2（1.延安大学附属医院；2.延安市药品检验所，陕西延安716000）摘要：目的减少实验过程中外界因素与人为因素给试验带来的误差，提高管碟法测定抗生素效价的准确性。
方法按药典操作步骤逐步分析，规范操作，并提出合理的解决方案。
结果得到清晰、圆整的抑菌圈。
结论可以提高测定结果的准确性。
关键词：抗生素效价；生物检定法—管碟法；抑菌圈中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：1672－2639（2011）03－0058－01抗生素是医疗上广泛使用的药品［1］。
由于抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌效力，利用抗生素对细菌（霉菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量抗生素的效力。
根据此原理，设定了抗生素效价的生物检定法—管碟法。
1基本原理管碟法是利用抗生素在琼脂培养内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
管碟法的特点是灵敏度高，能直接显示抗生素的抗菌效价，但操作步骤多，试验过程长。
影响试验结果的因素较多，需要从各个环节加以严格控制试验条件。
本文就对试验中各项影响因素的控制加以讨论。
2影响因素2.1抑菌圈圈正的控制在某些情况下，抑菌圈出现破裂，呈椭圆形，卵圆形等不正常形状，其原因［2］可能如下：（1）在滴加抗生素溶液至小管时，抗生素溶液从小管口或毛细滴管口溅出落在琼脂培养基表面上。
防止方法：毛细滴管内不得有气泡，毛细滴管口避免太细，毛细滴管离小管口距离不要太高，适当调节，使液滴下滴时不致溅出。
（2）小管两端面不够平，使抗生素溶液漏出，破坏了均匀扩散现象。
必须使用加工相同的小钢管。
如都用二端面平面的，或都使用二端面圆的。
（3）玻璃双碟、小钢管、钢管放置器被微量抗生素（或其他杀菌剂）污染，使抑菌圈破裂。
抗生素微生物检定管碟法
抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。
各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。
管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。
此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。
原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。
管碟法的操作步骤：1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。
2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。
4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。
5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。
6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。
7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
管蝶法测效价
管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
1. 实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。
小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。
如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。
由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。
因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。
160℃干热灭菌2h后备用。
2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基2.1 样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。
供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。
称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。
标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。
天平中的干燥剂应保持经常注意更换。
称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。
稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。
用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。
管碟法抗生素效价测量实验
管碟法抗生素效价测量实验抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。
管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。
当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于mic（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。
实验简介在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下:管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。
小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。
如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。
由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素(庆大霉素、争光霉素、链霉素等)或者被清洗用的杀菌剂(如新洁而灭、洗洁精、去污粉等)污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。
因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。
160℃干热灭菌2h后备用。
配制试验所需的样品及药品2.1 样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。
抗生素效价
用管碟法（2.2）法，测定链霉素活菌剂的效价，估计效价为1 000 000 u/g，供试品最终浓度为1.4u/ml 及0.7u/ml。
链霉素的效价测定抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效性）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液取短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）悬液取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
管碟法
实验2 管碟法测定土霉素生物效价一、目的要求1、了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
2、学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。
二、基本原理衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。
此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。
因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法的一种。
本实验采用管碟法测定抗生素的效价。
管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。
抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。
因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。
将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。
三、实验材料1、培养基（供摊布平板用）蛋白胨6g 酵母膏6g 牛肉膏1.5g 葡萄糖1g 琼脂15—18g蒸馏水1000ml pH:6.8 1.05kg/cm?/SPAN> 121.3?/SPAN>C灭菌20分钟2、菌种：黄色八叠球菌（Sarcina flava）3、土霉素碱标准品4、仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（5 00ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、温度计、牛津杯、镊子、培养盘、恒温箱、台秤等管碟法测定抗生素效价一、目的和要求1、了解管碟法的原理。
管碟法测定抗生素
管碟法测定抗生素
总结与展望
管碟法是一种经典的抗生素效价测定方法，具有操作简 便、直观等优点，广泛应用于药物研发、生产和质量控 制等领域。然而，随着科学技术的不断进步和新药的不 断涌现，管碟法也面临着一些挑战和改进的空间。未来 ，可以通过改进实验条件、优化操作流程和提高数据分 析能力等方式，进一步提高管碟法的准确性和可靠性， 为抗生素的研究和应用提供更加准确可靠的依据
操作规范：实验过程中应严格遵守无菌操作规范， 避免杂菌污染干扰 数据分析：在数据分析过程中，应采用适当的统计 方法对实验数据进行处理和分析，以获得准确可靠 的实验结果
管碟法测定抗生素
管碟法测定抗生素的优缺点
优点：(1)操作简便、直观，可快速获得实验结果； (2)适用于多种抗生素的效价测定，具有较好的通用 性；(3)可同时比较不同抗生素的ຫໍສະໝຸດ 菌效果，方便进 行药物筛选和质量控制
-
管碟法测定抗生素
A
管碟法是一种常用的抗生素效价测
定方法，其原理是将抗生素溶液置
于含有敏感菌的培养基中，通过测
定抗生素的抑菌圈大小来确定其效
价
B
下面将对管碟法测定抗生素的步骤 、注意事项和优缺点进行详细介绍
管碟法测定抗生素
管碟法测定抗生素的步骤
培养基制备：将基础培养基加热溶解，灭菌后冷却至50℃左右，加入适量敏感菌悬液 ，摇匀后倒入无菌培养皿中，待凝固后备用 抗生素溶液制备：将待测抗生素溶解于适宜溶剂中，制备成不同浓度的溶液 放置管碟：在培养皿上放置无菌管碟，轻轻按压使管底与培养基紧密接触 滴加抗生素溶液：用微量移液器将不同浓度的抗生素溶液滴加到管碟上，每个浓度至 少做3个平行试验 培养：将培养皿放入恒温培养箱中培养一定时间(一般为16-24小时)，使敏感菌在培养 基上生长
管碟法测定抗生素效价详解
管碟法的操作步骤
预试验→试验准备→ 双碟底层的制备→
供试品、标准品溶液的制备→菌层的制备
→滴加抗生素溶液→双碟的培养→ 抑菌圈
的测量→结果的可靠性检验及效价测定
• 预试验：
确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、 使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所 致的抑菌圈直径在18～22mm。高剂量与 低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的 抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。
• 试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭 菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、 缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。
• 供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价，根据试验要求设计供 试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供 试品、标准品相关剂量的溶液。
1. 称量 称量前，将标准品从冰箱取出，使与温室平衡； 供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品 应用同一天平；吸湿性较强的抗生素，在称量前1～2 ｈ更换 天平内干燥剂。标准品与供试品的称量最好一次取样称取， 不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量 不可少于 20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸 水。样品的称样量最好不少于50mg。
一、试验前准备
• 双碟的挑选
内径约90mm，硬质玻璃或 塑料培养平皿，水平透明， 无色斑气泡
• 物品的清洗、灭菌
培养皿、钢管、刻度吸管清 洗后160℃干热灭菌2小时或 121℃高压蒸汽灭菌30min， 放置室温备用；陶瓷瓦盖要 定期清洗干燥。
牛津杯的挑选
内径（6.0±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm，外径 （7.8±0.1）菌的来源：检定菌种由中监所所提 供的冷冻干燥品。 检定菌的传代和接种： 芽胞杆菌3～6个月（其他细菌每个月） 用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物 代替原有的菌种，作为工作用（阳性对照）菌 种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要 求进行。
管碟法测定抗生素效价方法的优化研究
摘要:以实验室发酵的抗生素、杆菌肽为测 试品,通过用管碟法测定其效价,从而得到管 碟法测定抗生素效价的较优化的一般方法。 研究结果表明,上层培养基 8 源的成分以骨 蛋白胨、 鱼蛋白胨、 胰酪蛋白胨较好,培 养基的厚度影响显著； 其次是指示菌的浓 度和上层培养基的酸碱度对测定结果影响 较大。
1.1.3杆菌肽标准品!
美国 &7590FG离心机 （湘仪） ， 电子天平） ，多 功 能 微 生 物 自 动 测 量 仪） ， 高压灭菌 锅， 酸度计 ， 培养皿， 牛津杯， 振荡培 养箱， 生化培养箱 ， 细菌过滤器，取液 器。
1.2 方法
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 指示菌及发酵菌菌种来源! 指示菌金 黄色葡萄球菌 ， 发酵试验菌地衣芽孢杆菌 均由重庆师范大学应用微生物研究所提供。
1.1.2 培养基成分!
固体培养基。下层培养基：牛肉膏3g、 蛋 白胨10g、 氯化钠5g、 琼脂10g、 H2O1000ml, pH7.2、 121℃灭菌 30min。上层培养基：牛肉膏3g、 蛋白胨 10g、 氯化钠 5g、 琼脂 8g、 H2O1000ml , pH7.2、 121℃灭菌 30min。蛋白胨水培养基 。牛肉膏3g、 蛋白胨10g、 氯化钠5g、 琼脂20g 、 H2O1000ml, pH7.5。
测定抗生素效价的国际常用方法是管碟法，是利用 抗生素在特定实验菌的琼脂培养基内的扩散作用， 形成一定浓度的含抗生素的球型区， 抑制了试验 菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈， 将已知效价的 标准溶液和未知效价的供试样品溶液在相同条件 下进行培养， 比较两者的抑菌圈的大小， 利用 各种不同的计算原理， 就可以准确地测定出供试 样品的效价。但是在使用标准样品比较时， 由于 各种因素的影响使得抑菌圈在相同剂量下偏小， 不规则， 且对低剂量的效价难于测定， 使效价 测定的误差更大。为此， 本实验通过对影响测定 抑菌圈大小的各种因素进行比较试验及分析， 得 出杆菌肽效价测定的最佳条件。
抗生素生物效价测定
实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
抗生素生物效价测定(详细参考)
实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
管碟法抗生素微生物检定法讲座
因标准品与供试品同质，最低抑菌浓度 c＇相同，又在同一双碟上培养 Logc＇4πDTH
相等，所以②-①得：
M2＇
1
Logθ＝ Log─── ＝ ──── ( T22 - S22)
Ⅰ
M2
9.21DT
其中θ为供试品与标准品效价比率。
同理可推算出低剂量反应式：
M1＇
1
Logθ＝ Log─── ＝ ─── ( T12 - S12)
原因是相邻的小钢管之间的距离过小或形成的抑菌圈过大，相邻两小钢管扩散的抗生素溶液
互相叠加，超过该抗生素溶液对试验菌的最低抑菌浓度而形成卵圆或椭圆形抑菌圈。防止方
法有：使用钢管放置器安置钢管，使各钢管之间的距离均匀一致而避免过小；控制抑菌圈大
圈直径在 18～22mm 之间。
⑥培养温度不均匀，此操作会导致形成卵圆或椭圆形抑菌圈。其原因是温度影响细菌的
②小钢管底部二端面不平，此操作会导致形成卵圆或椭圆形抑菌圈。其原因是抗生素溶 液在琼脂培养基上扩散速度不一致。操作时使用加工相同的小钢管可防止此现象的发生。
③双碟、小钢管或其它器具被抗生素或其它杀菌剂污染。此操作会使抑菌圈破裂，有时 甚至使试验菌大部或全部被抑制，无法形成抑菌圈。因此，操作时一定要防止材料、器具、 环境被抗生素污染。
⑸试验菌也是影响抑菌圈直径的一重要因素。及时更换试验菌，使用新鲜菌液，可提高 试验的灵敏度，增大抑菌圈直径。例如，使用新开启的枯草芽孢杆菌测定乙酰螺旋霉素效价 时形成的抑菌圈大圈直径比使用旧的试验菌(2 年以上)提高 1～2mm。
⑹通过控制培养基中菌的浓度来控制抑菌圈直径。例如，乙酰螺旋霉素、泰乐菌素、螺 旋霉素形成的抑菌圈较小，为了提高抑菌圈直径，培养基中菌的浓度为 0.1～0.2％，需要 时还可以把原菌液稀释 3～5 倍。盐霉素、麦白霉素形成的抑菌圈较大，为了降低抑菌圈直 径，可以把菌液浓度提高至 2～3％。 三、抑菌圈清晰度的控制：
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制保藏用菌株
•将营养肉汤培养物，用接种针沾取菌苔（菌液），沿半固体
培养基中心向管底作直线穿刺。穿刺到保藏管中然后，放置2-8度冰箱保存，作为保
藏及传代用的菌株。
制工作用菌悬液
试验用菌种穿刺管1支，按无菌操作要求，接种于盛有30ml 普通琼脂培养基的大三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养 基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入消毒液中。 将已接种的三角瓶置35～37℃的培养箱中培养7～10天，用
• 当培养到一定时间，琼脂培养基的两种互动作用达到动态
平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌
圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制， 此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好 等于抗生素最低抑菌浓度。
量反应平行线原理：当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线 关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准 品的两条量-反应关系曲线相互平行。（中国药典二部附录XIV
4
基本操作及注意事项
管碟法的操作步骤
预试验 试验准备 双碟的制备 供试
品、
标准品溶液的制备 滴加抗生素溶 液 菌层的制备 双碟的培养 放置小钢管 抑菌圈的测量
结果的可 靠性检验及效价测定
预试验： 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗 生素浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定，即二 剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～
，保证双碟放置区域的平整。在双碟底部预先标记样品的高低浓度区
域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来
加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即
使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上
铺开，达到消除误差的目的。
试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或
22mm,三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈
直径在15～18mm.
高低剂量之比为2:1.
试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可
以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验 ，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌 液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过 久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的 敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯 ，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以 重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。 所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟 叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影 响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。
基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培
养基吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不 易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。 因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管 5mL，湿热灭菌后放在50℃水浴锅内保温(水浴温度：细菌 为48~50℃，芽孢可至60℃)。试验中，再分别加入菌液混 匀，配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5min使培养基
时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。换滴管重新
滴加。抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈
黑色。（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量
也有差异。）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去
多余部分。
双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养,培养箱中 水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。
2
基本原理
2010版药典二部附录及2015版药典，在适宜条件下，根据量
反应平行线原理，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用， 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小 ，测定供试品的效价。
抑菌圈的形成 • 两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩
散作用；另一种是试验菌的生长作用。
SH→TH→SM→TM→SL→TL（三剂量法）的顺序滴加。滴加之前，
滴管至少要用被滴液体冲洗3次。在滴加抗生素到小钢管的时候，由
于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，
继
续滴加容易造成气泡膨胀破裂，
使溶液溅落在琼脂培养基表面造
成破圈。因此一旦毛细管中出现
气泡或者残留，就重新吸取抗生
生物检定统计法）
菌液制备 根据中国药典2010年版二部附录要求，硫酸庆大霉素和硫酸
3
庆大霉素颗粒测效价，选取短小芽孢杆菌作为试验菌。 取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]的营养琼脂斜面培养物，接 种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日 ，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水
革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml
洗下芽孢，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得。置
5℃冰箱中保存。
革兰染色法
• 具体操作步骤： • ⑴涂片 • ⑵干燥（自然干燥、培养箱内） • ⑶固定（火焰） • ⑷染色（包含初染、媒染、脱色、复染四步）
涂片
染色 初染：草酸铵结晶紫染1分钟，自来水冲洗。 媒染：加碘液覆盖涂面染1分钟，自来水冲洗。 脱色：加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒 后自来水冲洗。 复染：加沙黄（复红）复染液30秒后，自来水冲洗 。 自然干燥或用吸水纸吸去水分，镜检。 染色的结果：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红 色。
温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养
基均匀铺开。
放置小钢管 放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相 邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影 响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太
靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面
，会影响抑菌圈的形状。
将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
流程图
半固体琼脂斜面 制菌悬液
冻干菌粉
营养肉汤
（复活）
穿刺管（保藏及传代用）
备注：每经过一次培养箱培养，菌的代数就增加一代。 参考：《药品微生物学检验技术》主编：苏德模 马绪荣 2007年出版
1.复活 从菌种保藏机构购回的标 准菌株，是冷冻干燥粉，需 经过复活。（冻干菌种为第0 代）
管碟法测定抗生素的效价
目录
1 2
3 4 5 6
• 概述 • 基本原理 • 菌液制备
• 基本操作及注意事项
• 操作要点 • 检定的影响因素
1
概述 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生
素效价测定方法。随着HPLC等化学分析技术的发展，
一些抗生素效价的测定已被化学方法所替代，但由
于以下原因，抗生素微生物检定法，目前在各国药
菌层的制备： 注意菌层培养基温度； 根据预试验确定加入菌
层培养基的菌液量,注意
制备菌层的速度和平整 度.
制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长
都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤
为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50℃水
浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养
小钢管放置时，要小心地从 同一高度垂直放在菌层培养 基上，不得下陷，不得倾斜 ，不能用悬空往下掉的方法 。放置之后，不能随意移动 ，要静置5min，使之在琼脂 内稍下沉降稳定后，再开始
滴加抗生素溶液。
滴加抗生素溶液：
注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序,保证滴加速度和加量的
均匀一致.
滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法）或者
典中仍占有重要地位。
1.微生物检定法可直观、特异的反应出抗生素药品 的抗菌活性，显示临床的特点。 2.多组分抗生素由于不同组分生物活性的差异，化
学测定结果难以准确表征组分、组成、含量和活性
的关系。
3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化
学分析方法表征其活性。 4.同时微生物法所需的仪器设备简单，成本低。
素溶液进行滴加，毛细管口应避 免太细，滴加的时候离开小钢管 口距离不要太高。
SL标品的低浓度
TH样品的高浓度
TL样品的低浓度
SH标品的高浓度
滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。在滴加中还 有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触， 有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。此
者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平
面，会给试验带来误差。加注60～80℃的培养基底层之后，
不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的 水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层 上，会给培养基菌层的加注带来影响。
供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价,根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤, 平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液. 依公司产品，硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用的是二剂量法 ，试验中，制成高、低浓度的溶液。 依中国药典2010版及2015版二部附录要求，
造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用
流水冲洗。
双碟的制备： 每只双碟加底层培养基约
20ml,待培养基凝固后,将双碟
放入35～37℃培养箱中,待用.
无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会
影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给
试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板
革兰染色注意事项
1.革兰染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰阳性
菌也可被脱色而被误认为革兰阴性菌；如脱色时间过短，
革兰阴性菌也会被误认为是革兰阳性菌。因此必须严格把