液即分配色谱法
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-20世纪60年代，普通色 谱法已经不能满足人们对 生物成分分析测试的要求
-高效液相色谱，high performance liquid chromatography即HPLC
高效液相色谱法 又称高压 高速、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色 谱的基础上发展起来的分析技术。
特别适用于高沸点、 不能气化或热稳定性 差的有机物分离分析， 生物化学与分子生物 学中的应用日益广泛。
• 吸附层析法(absorption chromatography)：固定相是 固体吸附剂，利用各组份在吸附剂表面吸附能力的差别 而分离。
• 分配层析(partition chromatography)：固定相为液体， 利用各组份在两液相中的分配系数不同而分离。
• 离子交换层析(ion exchange chromatography)：是以 具有离子交换性能的离子交换剂作固定相，利用他与流 动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合 物的一种方法。
层析技术概述
• 因其操作简便、高分辨率、高灵敏度、选择性好、样品 量少、结果准确等特点
• 适合于标本含量少,杂质含量多样品分析 • 尤其适用于生物样品的分离分析 • 层析技术成为已成为生物化学及分子生物学常用的分析
方法，是生命科学、医学实验技术等Fra Baidu bibliotek究领域必不可少 的手段和工具。
二、层析技术发展史
1903年，俄国植物学家茨维特 -将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形 -抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙柱 -石油醚洗涤柱子上→下：叶绿素b,a,叶黄素，胡萝卜素 -混合物的不同组分得到了分离 -得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法
第一节 体液氨基酸测定
一、氨基酸测定方法概述 氨基酸检测方法主要有筛查试验和定量试验 纸层析和薄层层析法用于氨基酸分析鉴定 离子交换法常用于氨基酸的分离、定量测定 全自动氨基酸分析仪应用，可对各种体液中 氨基酸进行测定 特异性强灵敏度高的酶法及HPLC
第21页
1．氨基酸自动分析仪
• 采用离子交换层析方式，对蛋白质水解液及各种游离氨 基酸的组分含量进行分析
检测器
五、高效液相层析
• 正相层析法：固定相极性大于流动相极性 • 正相层析由于极性化合物更容易被极性固定相所保留 • 正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 • 正相层析法一般可用于分离纯化极性大的分子，如磷脂、
甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等
五、高效液相层析
• 反相层析法：流动相极性大于固定相极性 • 反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，
• 以上各种层析法常应用于柱层析 (column chromatography)中，即将固定相装于柱内，使标本沿一 个方向移动而达到分离。
离子交换层析原理示意图
免疫亲和层析
免疫亲和层析
五、高效液相层析
• 高效液相层析（High performance liquid chromatography，HPLC）
与正相正好相反 • 反相层析用于分离非极性或弱极性化合物，如氨基酸和
多肽的分析,蛋白质的分离、碱基、核酸和核酸酶的分 析、甾体化合物的分析
五、高效液相层析
反相层析最为常用，优点： • 反相层析用流动相的价格比正相层析便宜 • 对操作环境的污染较小 • 非极性固定相表面的作用力弱，故色谱柱达到平衡比较快 • 梯度洗脱的柱子更易于“再生”
• 一次进样检测20～50种氨基酸，不需要更换体系，自动 完成
• 仪器基本结构及原理同普通HPLC相似，针对氨基酸分析 细节优化，如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯 度及柱温梯度控制等
• 样品用量只需数十至数百微升,在30min左右,即可测出各 种氨基酸含量
1931年，德国库恩重复茨维特实验，并分离60多种色素 1938年，从VB中分离B6,出色的研究获得1938年诺贝尔化学奖
1941年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液-液 即分配色谱法
-预测并实现气相色谱技术，1952年将色谱技术原理应用到分离
气体上，混合气体通过后，在另一端出现时得以分离
高压泵、进样装置、色谱柱、检测器
HPLC的特点 1.高压 2.高速 3.高效 4.高灵敏度
三、层析技术原理
• 层析系统由两相组成： 一是固定相，另一是流动相 • 流动相：携带流过整个系
统的流体 • 固定相：静止不动的一相
三、层析技术原理
• 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份 的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶 解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，各组分移动速度各异，因而可将各组份分离
• 若分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份， 最终达到分离各组分的目的。
四、层析技术分类
毛细管电泳
气相层析法
超临界层析 法
吸附层析 法
正相分配层析 法
层析 法
分配层析
柱层析法
法
（高效液相层
析）
反相分配层析 法
凝胶渗透层析法
液相层析
薄层层析 法
纸分配层析 法
离子交换层析法 亲和层析法
其他
四、层析技术分类
• 在经典液相色谱和气相色谱的基础迅速发展技术 • 由于固相填料颗粒小而均匀，会引起高阻力，采用高压输
送流动相，可大大加快分析速度，故又称高压液相色谱 • 高效液相色谱仪一般由高压输液系统、进样分离系统、检
测系统、数据系统等组成。
储液器
高效液相分析仪结构示意图
馏分装置
数据处理系统
输液泵
选择装置
层析柱
④ ③② ①
层析法进行时有两个相 固定相（支持物），流动相（含待分离物质）。
固定相-碳酸钙
流动相-石油醚
这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端,之后 20多年，无人关注这一伟大发明
Michael Tswett (1872 - 1919), the inventor of the method of column chromatography
四、层析技术分类
• 凝胶层析（gel chromatography）：固定相为多孔性凝胶， 利用各组份的分子大小、形状不同，在凝胶上受阻滞的程 度不同而得到分离。
• 亲和层析(affinity chromatography)：利用待分离物质 和他的特异性配体间具有特异亲和力从而与其他组份分离， 如免疫亲和层析。
-高效液相色谱，high performance liquid chromatography即HPLC
高效液相色谱法 又称高压 高速、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色 谱的基础上发展起来的分析技术。
特别适用于高沸点、 不能气化或热稳定性 差的有机物分离分析， 生物化学与分子生物 学中的应用日益广泛。
• 吸附层析法(absorption chromatography)：固定相是 固体吸附剂，利用各组份在吸附剂表面吸附能力的差别 而分离。
• 分配层析(partition chromatography)：固定相为液体， 利用各组份在两液相中的分配系数不同而分离。
• 离子交换层析(ion exchange chromatography)：是以 具有离子交换性能的离子交换剂作固定相，利用他与流 动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合 物的一种方法。
层析技术概述
• 因其操作简便、高分辨率、高灵敏度、选择性好、样品 量少、结果准确等特点
• 适合于标本含量少,杂质含量多样品分析 • 尤其适用于生物样品的分离分析 • 层析技术成为已成为生物化学及分子生物学常用的分析
方法，是生命科学、医学实验技术等Fra Baidu bibliotek究领域必不可少 的手段和工具。
二、层析技术发展史
1903年，俄国植物学家茨维特 -将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形 -抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙柱 -石油醚洗涤柱子上→下：叶绿素b,a,叶黄素，胡萝卜素 -混合物的不同组分得到了分离 -得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法
第一节 体液氨基酸测定
一、氨基酸测定方法概述 氨基酸检测方法主要有筛查试验和定量试验 纸层析和薄层层析法用于氨基酸分析鉴定 离子交换法常用于氨基酸的分离、定量测定 全自动氨基酸分析仪应用，可对各种体液中 氨基酸进行测定 特异性强灵敏度高的酶法及HPLC
第21页
1．氨基酸自动分析仪
• 采用离子交换层析方式，对蛋白质水解液及各种游离氨 基酸的组分含量进行分析
检测器
五、高效液相层析
• 正相层析法：固定相极性大于流动相极性 • 正相层析由于极性化合物更容易被极性固定相所保留 • 正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 • 正相层析法一般可用于分离纯化极性大的分子，如磷脂、
甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等
五、高效液相层析
• 反相层析法：流动相极性大于固定相极性 • 反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，
• 以上各种层析法常应用于柱层析 (column chromatography)中，即将固定相装于柱内，使标本沿一 个方向移动而达到分离。
离子交换层析原理示意图
免疫亲和层析
免疫亲和层析
五、高效液相层析
• 高效液相层析（High performance liquid chromatography，HPLC）
与正相正好相反 • 反相层析用于分离非极性或弱极性化合物，如氨基酸和
多肽的分析,蛋白质的分离、碱基、核酸和核酸酶的分 析、甾体化合物的分析
五、高效液相层析
反相层析最为常用，优点： • 反相层析用流动相的价格比正相层析便宜 • 对操作环境的污染较小 • 非极性固定相表面的作用力弱，故色谱柱达到平衡比较快 • 梯度洗脱的柱子更易于“再生”
• 一次进样检测20～50种氨基酸，不需要更换体系，自动 完成
• 仪器基本结构及原理同普通HPLC相似，针对氨基酸分析 细节优化，如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯 度及柱温梯度控制等
• 样品用量只需数十至数百微升,在30min左右,即可测出各 种氨基酸含量
1931年，德国库恩重复茨维特实验，并分离60多种色素 1938年，从VB中分离B6,出色的研究获得1938年诺贝尔化学奖
1941年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液-液 即分配色谱法
-预测并实现气相色谱技术，1952年将色谱技术原理应用到分离
气体上，混合气体通过后，在另一端出现时得以分离
高压泵、进样装置、色谱柱、检测器
HPLC的特点 1.高压 2.高速 3.高效 4.高灵敏度
三、层析技术原理
• 层析系统由两相组成： 一是固定相，另一是流动相 • 流动相：携带流过整个系
统的流体 • 固定相：静止不动的一相
三、层析技术原理
• 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份 的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶 解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，各组分移动速度各异，因而可将各组份分离
• 若分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份， 最终达到分离各组分的目的。
四、层析技术分类
毛细管电泳
气相层析法
超临界层析 法
吸附层析 法
正相分配层析 法
层析 法
分配层析
柱层析法
法
（高效液相层
析）
反相分配层析 法
凝胶渗透层析法
液相层析
薄层层析 法
纸分配层析 法
离子交换层析法 亲和层析法
其他
四、层析技术分类
• 在经典液相色谱和气相色谱的基础迅速发展技术 • 由于固相填料颗粒小而均匀，会引起高阻力，采用高压输
送流动相，可大大加快分析速度，故又称高压液相色谱 • 高效液相色谱仪一般由高压输液系统、进样分离系统、检
测系统、数据系统等组成。
储液器
高效液相分析仪结构示意图
馏分装置
数据处理系统
输液泵
选择装置
层析柱
④ ③② ①
层析法进行时有两个相 固定相（支持物），流动相（含待分离物质）。
固定相-碳酸钙
流动相-石油醚
这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端,之后 20多年，无人关注这一伟大发明
Michael Tswett (1872 - 1919), the inventor of the method of column chromatography
四、层析技术分类
• 凝胶层析（gel chromatography）：固定相为多孔性凝胶， 利用各组份的分子大小、形状不同，在凝胶上受阻滞的程 度不同而得到分离。
• 亲和层析(affinity chromatography)：利用待分离物质 和他的特异性配体间具有特异亲和力从而与其他组份分离， 如免疫亲和层析。