牙髓间充质干细胞生产

牙髓间充质干细胞生产 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

牙髓间充质干细胞生产

I．目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。

II．范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。

III．职责：

1.生产主管负责本制度的执行和监督；

2.技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作；

3.监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》。

附表1牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录

附表2生产试剂耗材记录表

IV．规程：

一、牙髓间充质干细胞原代操作

消化法：

1.仪器耗材

1）10ml移液管

2）培养皿

3）50ml离心管

4）100μm筛网

5）T75培养瓶

6）15ml离心管

2.试剂

1）生理盐水

2）培养基

3）胶原酶

3.酶消化法操作流程

将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；

取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中；

用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至

30ml,再加入%胶原酶；

置于37℃恒温摇床，180rmp消化30min；

用100μm滤网过滤；

离心10min，吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；

附表3样本取样单

培养弃剩余上清，调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃，CO

2

箱中进行培养。

4.组织块法操作流程：

将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；

取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中；

用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS 润湿瓶底）瓶底；

倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培养箱中培养；

后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。

二、牙髓间充质干细胞换液

1.耗材

1）10ml移液管

2）15ml离心管

2.试剂

培养基

3.操作流程

镜下观察状态细胞；

吸取上清液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；

吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），并补充新的培养基；

孵箱中培养。

观察细胞并将其置于37℃，5%CO

2

三、牙髓间充质干细胞传代培养

1.耗材

1）10ml移液管

2）50ml离心管

3）培养瓶

4）15ml离心管

2.试剂

1）生理盐水

2）胰酶

3）血清

4）培养基

3.操作流程

显微镜观察，观察培养瓶中的细胞密度到达80%—90%，可进行传代培养；

吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤贴壁细胞；

吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；

倒出剩余洗涤液（生理盐水），再加入10ml生理盐水+%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化；

将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，6min，弃上清，重悬，加入培养基，然后按照1:2或1:3进行传代。

四、牙髓间充质干细胞成品制备

1.耗材

1）10ml移液管

2）50ml离心管

3）15ml离心管

4）西林瓶/输血袋

2.试剂

1）生理盐水

2）胰酶

3）血清

4）干细胞保存液

3.操作流程

待细胞扩增总数达所需细胞数量后，吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），T75培养瓶中加入10ml生理盐水洗涤一遍；

加入10ml生理盐水+%胰酶，进行细胞消化，消化的第一瓶镜下观察，细胞收缩即可加入等体积血清终止消化；

将细胞收集到50ml离心管中，1200rpm，10min；

弃上清，细胞沉淀用30ml生理盐水洗涤二次，1200rpm，室温离心10min。

取第二次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分，并填写《样本取样单》；用干细胞保存液/生理盐水重悬细胞，转入专用的无菌西林瓶/生理盐水中，封口，贴标签，放置4℃保存。

完成初包装后，操作员立即将成品送交包装部门。

五、牙髓间充质干细胞的冻存

1.耗材

1）10ml移液管

2）50ml离心管

3）15ml离心管

4）冻存管

2.试剂

1）生理盐水

2）胰酶

3）血清

4）冻存液

3.操作流程

将制备好的MSC于1200rpm室温，离心10min。

弃去上清，将细胞悬浮于适量冻存液中，使细胞浓度在107个细胞/毫升，置于低温无菌冻存管中。

将细胞交给库管员经过程控降温后于液氮中冷冻保存，并填写《冻存样品交接单》。

附表4冻存样品交接单

六、牙髓干细胞的复苏

1.耗材

1）10ml移液管

2）50ml离心管

3）15ml离心管

4）培养瓶

2.试剂

1）生理盐水

2）培养液

3.操作流程

将液氮中的细胞取出于37℃水浴中迅速融化；

将细胞置于装有10~15倍ml生理盐水无菌离心管中，1200rpm离心10min；弃上清，加入30ml生理盐水洗涤细胞两次；

取第一次洗涤离心后的上清20ml交给给质检部分，并填写《样本取样单》；弃上清，重悬细胞，在细胞悬液中加入培养液，吹匀；

将单细胞悬液种植于细胞培养瓶，继续培养。

备注：

1.每次进行操作前，需将万级车间和百级实验台照射紫外线30min，风机开启后10-15min后方可进入实验场所进行操作；

2.进入GMP车间后，实验人员先进入物品存放间取已经表面消毒过的垃圾桶、废液缸、实验耗材等进入相应操作间，并从配液间取出相关使用试剂放于实验操作台；