pH值法唾液尿素酶试验检测幽门螺杆菌研究

pH值法唾液尿素酶试验检测幽门螺杆菌研究目的：探讨pH值法唾液快速尿素酶试验（SRUT）检测幽门螺杆菌（Hp）的价值。

方法：对1600例患者，用SRUT和14C-尿素呼气试验（14C-UBT）检测Hp，统计两种试验检测的结果，以14C-UBT为金标准，用贝叶斯定理方法对SRUT进行评价。

检测结果的变异系数应≤10%。

结果：在1600例受检者中SRUT 阳性标本733例，阳性率为45.81%；14C-UBT阳性标本678例，阳性率为42.38%。

SRUT灵敏性为97.79%，特异性为92.41%，阳性预测值为90.45%，阴性预测值为98.27%，准确性为94.69%，差异性为5.31%，变异系数低于10%。

结论：SRUT 与14C-UBT在Hp的检测方面具有相同的应用价值，SRUT快捷、安全、简便、价廉，是一种检测Hp的新方法。

口腔存在大量的細菌，其中寄生在口腔的Hp与胃Hp具有同源性。

越来越多的资料阐明口腔是Hp的贮藏库，与口腔、胃肠道、呼吸系统等疾病具有相关性。

Hp的诊断方法朝简便、无创、快速、价廉的体外试验方向发展，如14C、13C-尿素呼气试验，唾液Hp检测、粪便Hp抗原测定和15N-尿氨排出试验等方法。

本院于2012年9月-2015年12月开展pH值法唾液尿素酶试验检测Hp，与14C-尿素呼气试验（14C-UBT）比较，变异系数为5.31%，低于试验允许变异系数（10%），现报告如下。

1 资料与方法1.1 一般资料选取2012年9月-2015年12月中山市坦背医院患者1100例（A组）和中山市东升医院患者500例（B组）。

试验由两组人员完成，采用双盲方法，男795例，女805例；男女比例=1∶1.01；男性年龄17～77岁，平均（39.81±12.18）岁。

女性年龄17～81岁，平均（40.66±11.05）岁。

两组受检者的性别、年龄方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 試验设备（1）自制的唾液尿素酶检测试剂盒，盒内包括：盛装唾液的量杯，检测范围5.5～9.0的pH精密试纸，管囊内装有（0.45±0.04）mL检测液的巴氏吸管；检测液由质量浓度120～150 g/L的尿素溶液（0.20±0.04）mL和95%乙醇溶液（0.25±0.02）mL组成，其中溶解医用尿素结晶的溶液为去离子水，每100 mL去离子水中尿素结晶12～15 g。

巴氏吸管的管部依次设有第一刻度标志和第二刻度标志，从第一刻度标志至第二刻度标志处管腔容量为（0.20±0.02）mL。

（2）HUBT-01型14C-尿素呼气检测仪。

1.3 检测要求要求受试者空腹，检查前不宜含服食品或药物，也不宜漱口，餐后者应隔2 h方可检查。

检测前2周内没使用抗菌药物和抗酸剂（包括质子泵拮抗剂）及铋剂，检查时无上消化道出血，无急性肝炎、肾功能不全和口腔疾病治疗期间。

1.4 SRUT检查步驟（1）用塑料量杯收集受检者唾液约0.5～1 mL。

（2）用剪刀沿吸管远端第一刻度标志处剪断，吸管嘴口向上，挤压管囊部上方（切忌将囊内检测液挤出），将吸管嘴插入塑料杯唾液内，缓慢松手，将唾液吸入至吸管第二刻度处即可，然后吸管嘴朝上斜置，唾液进入囊内与囊内检测液混合。

（3）用pH试纸测量塑料量杯中剩余唾液pH值。

（4）5～20 min后将囊内反应液滴在pH试纸上，将测得的pH值与唾液pH值比较。

1.5 14C-UBT检查步骤采集唾液后，受试者口服尿素胶囊；然后按常规步骤进行。

1.6 判定标准（1）SRUT：反应液pH值≥唾液pH值为阳性（Hp感染），反应液pH值0.05）。

2.3 SRUT与14C-UBT检测结果贝叶斯定理评价733例SRUT阳性标本对应14C-UBT阳性标本有70例假阳性；而867例SRUT阴性标本对应14C-UBT 阴性标本有15例假阴性；SRUT以14C-UBT为金标准，其检测结果通过公式计算：SRUT的灵敏性为97.79%，特异性为92.41%，阳性预测值为90.45%，阴性预测值为98.27%，准确性为94.69%，差异性为5.31%，见表1。

2.4 治疗后复查病例情况1600例受检者中85例属于Hp根治后复查病例，SRUT与14C-UBT检测结果：SRUT阳性45例、阴性40例；14C-UBT阳性41例、阴性44例。

SRUT对应14C-UBT假阳性6例、假阴性2例，SRUT灵敏性95.12%，特异性86.36%，阳性预测值86.67%，阴性预测值95.00%，准确性为90.59%，差异性为9.41%。

SRUT与14C-UBT检测结果比较，差异无统计学意义（x2=0.38，P>0.05）。

3 讨论大量研究资料表明口腔内存在Hp，并有较高的检出率[1-3]，而胃Hp感染患者大多存在口腔Hp感染。

从胃和口腔分离出的致病性Hp菌株的同源性证明口腔Hp是慢性胃病患者Hp感染的重要来源[4]。

口腔Hp的存在是胃病和复发的一个重要和直接的原因[5-8]。

Hp感染已明确与胃癌密切相关，近来有研究表明Hp感染与大肠肿瘤之间存在相关性，Hp感染可能增加大肠肿瘤发生的风险[9]。

14C-UBT是亚太地区、世界胃肠病组织、马斯特里赫特（MaatrichtⅣ）共识报告和《第四次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》推荐的检查方法[10]，是目前体外检测Hp的金标准。

鉴于口腔与胃Hp感染的密切关系，通过唾液、舌苔、牙菌斑等检测Hp的方法见诸报道[11-12]。

SRUT是缘于尿素酶能分解尿素产生氨和CO2，氨使溶液的pH值升高的原理设计的，根据唾液和反应液的pH值的变化判断是否存在幽门螺杆菌感染。

SRUT可行性的衡量标准：用14C-UBT（金标准）检验SRUT检测Hp的准确性，SRUT检测结果与14C-UBT变异系数应小于10%。

SRUT的临床检测结果以14C-UBT为金标准，主要目的是检验SRUT对胃幽门螺杆菌感染的诊断是否有应用价值。

唾液是口腔中的腮腺、頜下腺、舌下腺等三对大唾液腺及分布于上下唇、颊部等处的小唾液腺所分泌的液体。

包括水、无机物、有机物、黏膜上皮细胞，各种微生物及龈沟液等成分。

常态唾液pH值为6.0～7.9，本组受检者唾液pH值为5.5～8.0，平均为6.60±1.08。

用于SRUT的巴氏吸管囊内检测液由去离子水、尿素结晶和95%乙醇液组成，去离子水在pH试纸上显示的pH值5.5～6.0，尿素结晶pH值≤7.0，95%乙醇pH值≤5.5；三者混合后溶液pH值≤5.5，低于常态唾液pH值（6.0～7.9）。

巴氏吸管囊内检测液容量（0.45±0.04）mL是所取唾液的2.25倍，低pH值和两倍于唾液标本的检测液对唾液标本起到稀释、降低唾液pH值作用。

如果唾液中含有Hp产生的尿素酶，分解尿素产生氨使反应液的pH值升高，否则反应液的pH 值低于唾液pH值。

SRUT是测量当时所取唾液的pH，并同时测量唾液与检测液反应后溶液的pH值，所以实验不受不同时间段唾液pH值的变化影响。

pH試纸用于测量唾液和反应液的酸碱度，获得检测结果。

用于测量pH值的试纸有数值色泽对照板，方便读取pH值，对位于某一区间值者采用模糊记录，如唾液或反应液pH值位于6.0～6.5，可记录为6～6.5，略大于6者或接近6.5者，可以6～或～6.5记录。

pH试纸最佳色泽显示时间为60～120 s，此时段SRUT 的检测结果与14C-UBT结果最接近。

被唾液或反应液浸湿的pH试纸显色时间越久，色泽逐渐变淡，读数降低，影响结果判断。

由于口腔中的唾液链球菌、内氏放线菌、沃氏葡萄球菌等不同程度分泌尿素酶对实验结果产生影响[13]，但这类细菌的尿素酶位于细胞质中，SRUT采用95%乙醇溶液，减少了这类细菌分泌尿素酶对实验结果的影响。

而Hp尿素酶位于细胞膜上和细胞膜外，能迅速与尿素发生反应，不受乙醇的影响。

另外，95%乙醇溶液还可起到祛除唾液泡沫、防腐、去污等作用，保护和延长检测试剂的使用期限。

在实验早期的研究中，没有经过95%乙醇固定的300例唾液标本假阳性率高达到30%，乙醇溶液和pH测量介入后，假阳性率降至10%以下，明显提高了实验的准确性。

pH值的测量是根据尿素酶分解尿素产生氨，使溶液的pH值升高的原理建立的。

RUT试剂底物中的酚红在溶液pH值≥6.8时释出，使溶液变成红色，实验为阳性，存在Hp感染。

RUT是一种通过显色的定性试验。

作者在舌苔快速尿素酶试验的研究中发现在呈红色的标本中溶液的pH值有些≤6.8，或者更低，这些标本中有假阳性。

通过检测口腔和反应溶液的pH值可以鉴别出假阳性标本，减少了误报率；对不变色的标本也进行pH值测量，发现有假阴性标本。

本实验所用试剂中不含酚红，试剂不变色，对全部反应液进行pH值测量，直接得出检测结果。

所用乙醇可以减少唾液及其他成分对试验的干扰，降低非Hp因素所致的假阳性率；pH测量减少了标本的假阳性和假阴性率[14]。

SRUT与14C-UBT检测结果存在一定的差异，本组试验两者的差异性为5.31%，标本产生相差异的原因可能是尿素胶囊在胃内溶解后覆盖的面积不够，或接触的区域所含尿素酶量少、活性低；在空腹状态下胃排空加快，尿素与胃黏液层接触时间短，接触面积不够；Hp胃内“灶性”分布特点同样对14C-UBT产生影响[15]，另外，饮食习惯和疾病性质等因素也存在影响[16-17]。

口腔Hp感染高于胃Hp感染也是差异的原因之一[18]，也可能是口腔中其他细菌分泌的尿素酶所致。

SRUT假阴性标本可能是口腔中不存在Hp或受检者在检查前曾洗漱口腔、口腔疾病近期治疗等因素使唾液中尿素酶含量低所致。

由于口腔的微生态环境与胃内不同，细菌培养、快速尿素酶试验（RUT）、聚合酶链反应（PCR）等胃内Hp的检测方法在检测口腔Hp感染时结果存在很大差异[11]。

在85例Hp根治后复查病例中SRUT与14C-UBT检测结果比较，差异无统计学意义（x2=0.38，P>0.05）；贝叶斯公式计算，差异性为9.41%，低于试验允许变异系数（10%）。

但根除后阳性率较高，说明治疗效果不佳。

口腔中有较高的Hp检出率，胃Hp感染患者中大多存在口腔Hp感染。

Hp根除治疗对杀灭胃内Hp有一定疗效，对口腔Hp感染几乎无效[19]。

对于Hp感染病例应追踪治疗效果，查找失败原因，特别是口腔Hp感染者，要及时调整治疗方案。

由于pH值是通过肉眼分辨的，对SRUT结果有疑虑时，可再取一份唾液进行检测，比较两份的检测结果，以pH值高者为最终检测结果。

尿素酶的活性受温度的影响，正常室温（16～26 ℃）状态下活性较好，寒冷时活性较低，高温时反应加速。