无菌操作技术原理及实验
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弄乱样品。
※穿刺接种
用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半 固体的深层培养基中的接种方法。
• 用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏Βιβλιοθήκη Baidu种。
• 只适宜于细菌和酵母的接种培养
接种步骤： （1）手持试管 （2）旋松棉塞 （3）接种针灼烧灭菌，把在穿刺中可能伸入试管的其他 部位也灼烧灭菌 （4）拔出棉塞 （5）取菌：用冷却接种针的针尖沾取少量菌种 （6）穿刺：将接种针自培养基中心平稳、快速垂直刺入
• 加水：水位至平台处，不要过多。使用 去离子水。
• 摆放：相互间有适当缝隙，有利于蒸汽 的穿透，提高灭菌效果。
•注意密：封：顺时针旋转，直到不到旋转为止 。 • 高压带有液体的瓶子时要旋松瓶盖，防止瓶内压力过大使
瓶子碎裂；
•• 加包有热报纸：的打物品开，立开即进关行干，燥检处理查。 温度和时间。
抗生素的配制 及保存：
• 灭菌器材：枪头、玻璃器皿、培养基、无菌衣等进 行高压灭菌处理。
培养基的 制备：
• 目的菌：大肠杆菌
• LB培养基：（蛋白胨易吸湿，应迅速称取；称取一种药品后，药匙
洗净擦干后再称另一种药品。）
• pH: 7.4-7.6；（勿调过头，以免回调而影响各离子浓度。）
• 分装要求：（分装时，不要使培养基沾在瓶口，以免玷污瓶塞而引起
※划线接种与平 使混合板的涂细布菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得
纯菌、活菌计数。 方法：
★ 分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ★ 连续划线法：适用于含菌量较少的标本
分区划 线法
连续划 线法
注意： • 平板倒置放置（防止皿盖水珠滴在菌落上；重力作用下营养下
沉为菌体提供营养）。 • 平皿底部标注姓名、日期及样品名，防止平皿较多时错盖皿盖
污染。）
液体：试管：试管高度的1/4； 三角瓶 ：不超过容积的1/2；
固体：试管：不超过1/5，灭菌后制成 斜面； 平皿：15ml。
灭菌方式
• 辐：射灭菌：60Co-γ射线，医疗器械、容器、 生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成 品等。
• 干热灭菌法：利用干热空气达到杀灭微生物 或消除热原物质的方法。 160~170℃*120min 以上、170~180℃*60min
• 使用前打开紫外灯照射40~60分设钟定的方向流动而形成
超 净
•
的开。启）超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧
乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。
台
的•
使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫
使
拭；
用 • 请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；
与 维
•
使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；
培养基，至接近试管 底部，然后沿接种线拔出
（7）塞上棉塞
细胞培养
• 细胞室无菌环境的保持与维护：
进入细胞室前，在缓冲间换实验服、换拖鞋；每 天早上打扫细胞并紫外照射半小时。
• 培养箱的使用与维护：
定期灭菌； 按位置摆放细胞瓶，方便查找，以免长时间敞
护•
使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯
照射15分钟.
• 定期将初效过滤器拆下清洗，清洗周期一般为3-6个月；高效空气过滤
无菌操作要 求：
（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作； （2）使用玻璃器皿应轻取轻放。 （3）在火焰上方操作，水平距离5cm范围内为无菌区域。 （4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）在接种培养物时，动作应轻、准。 （6）不能用嘴直接吸吹吸管。 （7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的
无菌操作技术原理及实验
无菌操作技术
定义： 指在实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干 扰的一系列操作方法和有关措施。
范围： 微生物无菌操作技术； 细胞无菌培养。
目的： 保证培养物不被环境中微生物污染； 防止被检微生物在操作中污染环境或感 染操作人员。
微生物无菌操作技术及接种技 术
原理：
• 选用合适溶剂溶解后，0.22um过滤除菌。 • 氨苄青霉素：-20℃长期保存，4℃保存一个月，37℃
保存2-3天。 • 卡那霉素、四环素、链霉素：-20℃长期保存，4℃、
37℃比氨苄保存时间稍长，四环素避光保存。
无菌环境的要求
与保持： 无菌
无菌室
环境 超净工作台（原理：在特定的空间内，洁净空
气（过滤空气）按
以上或250℃*45min。 适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物
品灭菌，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制 品、
固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。
• 湿热灭菌法：热力灭菌中最有效、应用最广 泛。121℃、30min。药品、容器、培养基、 无菌
高压灭菌锅操作步骤及 注意事项：
• 仪器检查：仪器摆放在水平地面上，周 围有空隙。
※ 液体接种
由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方 法。 意义：质粒的扩增，蛋白的大量表达。
操作方法： • 与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养 基时使环在液体与 管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉塞 再轻轻摇匀。 • 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管 或滴管接种
消毒桶内消毒。 （8） 酒精灯使用时，酒精量不超其容积的2/3，也不能少于1/3。
接种技 术：
接种的基本程序：
•
灭菌接种工具 杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本
沾取标本 接种
•操作需在无菌室或超净工作台 内进行 •无菌室、超净工作台使用前后 需进行消毒。 •实验使用的物品使用前后需严 格灭菌
常用接种方 法：
无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类 微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。
接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上 或活的生物体内的过程。
无菌操作材料：
接种工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种 锄 8.小解剖刀
无菌器材准 备：
• 斜面接 种
• 划线接 种
• 液体接 种
• 穿刺接 种
灭菌接种工具 杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境
※ 斜面接种：
• 从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜 面培养基上的接种方法。
• 用于需氧性微生物的接种。 1) 标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种
人姓名 2) 点燃酒精灯。 3) 接种步骤：
※穿刺接种
用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半 固体的深层培养基中的接种方法。
• 用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏Βιβλιοθήκη Baidu种。
• 只适宜于细菌和酵母的接种培养
接种步骤： （1）手持试管 （2）旋松棉塞 （3）接种针灼烧灭菌，把在穿刺中可能伸入试管的其他 部位也灼烧灭菌 （4）拔出棉塞 （5）取菌：用冷却接种针的针尖沾取少量菌种 （6）穿刺：将接种针自培养基中心平稳、快速垂直刺入
• 加水：水位至平台处，不要过多。使用 去离子水。
• 摆放：相互间有适当缝隙，有利于蒸汽 的穿透，提高灭菌效果。
•注意密：封：顺时针旋转，直到不到旋转为止 。 • 高压带有液体的瓶子时要旋松瓶盖，防止瓶内压力过大使
瓶子碎裂；
•• 加包有热报纸：的打物品开，立开即进关行干，燥检处理查。 温度和时间。
抗生素的配制 及保存：
• 灭菌器材：枪头、玻璃器皿、培养基、无菌衣等进 行高压灭菌处理。
培养基的 制备：
• 目的菌：大肠杆菌
• LB培养基：（蛋白胨易吸湿，应迅速称取；称取一种药品后，药匙
洗净擦干后再称另一种药品。）
• pH: 7.4-7.6；（勿调过头，以免回调而影响各离子浓度。）
• 分装要求：（分装时，不要使培养基沾在瓶口，以免玷污瓶塞而引起
※划线接种与平 使混合板的涂细布菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得
纯菌、活菌计数。 方法：
★ 分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ★ 连续划线法：适用于含菌量较少的标本
分区划 线法
连续划 线法
注意： • 平板倒置放置（防止皿盖水珠滴在菌落上；重力作用下营养下
沉为菌体提供营养）。 • 平皿底部标注姓名、日期及样品名，防止平皿较多时错盖皿盖
污染。）
液体：试管：试管高度的1/4； 三角瓶 ：不超过容积的1/2；
固体：试管：不超过1/5，灭菌后制成 斜面； 平皿：15ml。
灭菌方式
• 辐：射灭菌：60Co-γ射线，医疗器械、容器、 生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成 品等。
• 干热灭菌法：利用干热空气达到杀灭微生物 或消除热原物质的方法。 160~170℃*120min 以上、170~180℃*60min
• 使用前打开紫外灯照射40~60分设钟定的方向流动而形成
超 净
•
的开。启）超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧
乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。
台
的•
使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫
使
拭；
用 • 请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；
与 维
•
使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；
培养基，至接近试管 底部，然后沿接种线拔出
（7）塞上棉塞
细胞培养
• 细胞室无菌环境的保持与维护：
进入细胞室前，在缓冲间换实验服、换拖鞋；每 天早上打扫细胞并紫外照射半小时。
• 培养箱的使用与维护：
定期灭菌； 按位置摆放细胞瓶，方便查找，以免长时间敞
护•
使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯
照射15分钟.
• 定期将初效过滤器拆下清洗，清洗周期一般为3-6个月；高效空气过滤
无菌操作要 求：
（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作； （2）使用玻璃器皿应轻取轻放。 （3）在火焰上方操作，水平距离5cm范围内为无菌区域。 （4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）在接种培养物时，动作应轻、准。 （6）不能用嘴直接吸吹吸管。 （7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的
无菌操作技术原理及实验
无菌操作技术
定义： 指在实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干 扰的一系列操作方法和有关措施。
范围： 微生物无菌操作技术； 细胞无菌培养。
目的： 保证培养物不被环境中微生物污染； 防止被检微生物在操作中污染环境或感 染操作人员。
微生物无菌操作技术及接种技 术
原理：
• 选用合适溶剂溶解后，0.22um过滤除菌。 • 氨苄青霉素：-20℃长期保存，4℃保存一个月，37℃
保存2-3天。 • 卡那霉素、四环素、链霉素：-20℃长期保存，4℃、
37℃比氨苄保存时间稍长，四环素避光保存。
无菌环境的要求
与保持： 无菌
无菌室
环境 超净工作台（原理：在特定的空间内，洁净空
气（过滤空气）按
以上或250℃*45min。 适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物
品灭菌，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制 品、
固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。
• 湿热灭菌法：热力灭菌中最有效、应用最广 泛。121℃、30min。药品、容器、培养基、 无菌
高压灭菌锅操作步骤及 注意事项：
• 仪器检查：仪器摆放在水平地面上，周 围有空隙。
※ 液体接种
由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方 法。 意义：质粒的扩增，蛋白的大量表达。
操作方法： • 与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养 基时使环在液体与 管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉塞 再轻轻摇匀。 • 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管 或滴管接种
消毒桶内消毒。 （8） 酒精灯使用时，酒精量不超其容积的2/3，也不能少于1/3。
接种技 术：
接种的基本程序：
•
灭菌接种工具 杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本
沾取标本 接种
•操作需在无菌室或超净工作台 内进行 •无菌室、超净工作台使用前后 需进行消毒。 •实验使用的物品使用前后需严 格灭菌
常用接种方 法：
无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类 微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。
接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上 或活的生物体内的过程。
无菌操作材料：
接种工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种 锄 8.小解剖刀
无菌器材准 备：
• 斜面接 种
• 划线接 种
• 液体接 种
• 穿刺接 种
灭菌接种工具 杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境
※ 斜面接种：
• 从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜 面培养基上的接种方法。
• 用于需氧性微生物的接种。 1) 标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种
人姓名 2) 点燃酒精灯。 3) 接种步骤：