SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤.

【跑电泳的步骤】

1、取出电泳仪器和四个烧杯；

2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；

3、配制过硫酸铵溶液（AP）：0.1gAP+0.9g超纯水，保鲜膜封口；

4、取出所有药品。Tris-HCL(88,6.8)，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好；

5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；

6、先配分离胶

7、组装凝胶模具，插好板

（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；

（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。

8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；

9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；

10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；

11、配浓缩胶；

12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；

13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。），样品煮沸3分钟；

14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；

15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV；

16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。

【附配方】

分离胶 separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL) 1板 2板

Prescription 12% 10% 7.5% 3.5 mL 7.0 mL

Del H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL

1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL 0.91 mL 1.82 mL

30%Acry/bis 2 mL 1.7 mL 1.3 mL 1.19mL 1.38 mL 单体胶（29.2g+0.8g/100mL）10%SDS 50uL 50uL 50uL 35uL 70uL

10%AP 50uL 50uL 50uL 35uL 70uL

7uL(夏)~8TEMED 2uL 2uL(5 uL) 2uL 3.5uL uL

浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)

Prescription Volume(2 mL) (2 mL)

Del H2O 1.4mL 2.1mL

0.5M Tris-HCL pH6.8 250uL 375uL

30%单体胶 330uL 495uL

10%SDS 20uL 30uL

10%AP 20uL 30uL

TEMED 2uL(5 uL) 3uL(8 uL冬，5 uL夏)

【附所需试剂配制】

1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，2.67%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g； (100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，0.45 uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（m/V），可选择的范围为

3%~30%；%C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m），也指交联度。

2、分离胶缓冲液pH8.8配制100mL(1.5M Tris-HCL pH8.8)：Tris 18.15g，部分去离子水溶解，并用HCL调pH8.8，最后定容至100 mL，过0.45 uM膜，4℃保存。

3、浓缩胶缓冲液pH6.8配制50mL(0.5M Tris-HCL pH6.8)：Tris 3.0g，部分去离子水溶解，并用HCL调pH6.8，最后定容至50 mL， 4℃保存。

4、10%SDS：5g/50 mL H2O，配制后 4℃保存。

5、10%AP（过硫酸铵）：用时现配，溶解状态十分不稳定，0.1g/1mL H2O。.

6、电泳缓冲液：配1000 mL

Tris 3.0g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g，去离子水定容至1000 mL。

7、染色液：

（1）原液：配制200 mL：考马斯亮蓝（R-250）：2.0g+200 mL去离子水；（2）染色液：配制500 mL：原液62.5mL，甲醇250mL，冰乙酸50mL，去离子水137.5mL。

8、脱色液：1000 mL

甲醇500 mL，冰乙酸100 mL，去离子水定容至1000 mL。

9、TEMED原液

稳压：Stacking：90V（20mA），Seperate：120V（25mA）。