(中文) DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒 I

DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I DIG High Prime DNA标记及杂交检测试剂盒I

说明书版本：Version11 （2010年8月）

利用随机引物法及DIG-dUTP（碱不稳定）进行DNA标记反应，采用酶联免疫方法及发色底物NBT/BCIP进行杂交分子的显色。

本试剂盒可对10ng-3μg DNA进行12次标记反应，可进行24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）。

产品目录号：11 745 832 910

试剂盒于-15 ~ -25℃保存

1. 概况

1.1 说明书内容

1. 概况 (2)

1.1说明书内容 (2)

1.2试剂盒组成 (3)

2. 介绍 (4)

2.1 产品概述 (4)

3. 实验步骤和需要的材料 (7)

3.1 实验开始前准备 (7)

3.2 DIG-DNA标记 (7)

3.3定量标记反应效率 (10)

3.4 DNA转膜和固定 (12)

3.5杂交 (13)

3.6 免疫检测 (14)

3.7探针洗脱和重探 (16)

4. 结果 (17)

4.1 典型结果 (17)

5 附录 (18)

5.1 疑难问题解决 (18)

5.2参考文献 (18)

1.2 试剂盒组成

杂交反应所需的仪器和其他反应试剂

请根据您的实验操作流程准备杂交反应所需的仪器和其他试剂，参见下表：

带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。

2. 介绍

2.1 产品概述

反应原理

DIG High Prime DNA标记检测试剂盒（I）采用地高辛（DIG，一种甾类半抗原）进行DNA 标记，所获得的探针用于后续的杂交反应，带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应进行显色检测。

应用

DIG标记的DNA探针可用于：

•所有形式的膜杂交反应

•（微生物，人类，植物等）基因组DNA中的单拷贝基因检测

样本

•大小在100bp以上的DNA片段

•线性化质粒，粘粒或λDNA

•超螺旋DNA

分析时间

试剂盒反应次数

本试剂盒包含

•对10ng-3μg DNA进行12次标记反应

• 24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）

质量控制

对DNA对照品（pBR328，未标记）进行标准标记反应，将0.1pg同源DNA点膜后进行斑点杂交，显色16h呈阳性检测结果（1pg同源DNA的杂交反应显色1h后呈阳性检测结果）。

试剂盒保存/稳定性

未开启的试剂盒可在-15 ~ -25℃下稳定保存至产品有效期限，具体日期请见试剂标签说明。试剂盒需在干冰条件下运输。

试剂盒开启后，不同的试剂盒组分请在下表所列的条件下保存：

灵敏度和特异性

1μg人胎盘DNA酶切消化后，进行Southern blot检测，可检出人单拷贝基因。

注意：试剂盒检测灵敏度决定于杂交实验中标记DNA的使用浓度，以及显色反应时间。优势

3. 实验步骤和需要的材料

3.1 实验开始前准备

实验操作建议

实验步骤

3.2 DIG-DNA标记

反应原理

利用随机引物法和地高辛标记的核苷酸DIG-11-dUTP对DNA进行标记，获得探针。DIG-High Prime为优化的5×预混反应液，包括含DIG-dUTP（碱不稳定）的dNTP混合液，随机引物，标记级别的Klenow酶和优化的反应缓冲液。

反应所需的仪器和其他试剂

•水浴设备

•冰或冰水浴

DNA模板

请见下表的DNA模板建议

凝胶中回收DNA模板

如果您进行的是基因组Southern blotting实验，应通过凝胶电泳将质粒中插入的模板DNA 进行切胶回收。建议使用High Pure PCR Product Purification Kit*或Agarose Gel DNA Extraction Kit*，获得更好的DNA回收结果。

反应步骤

下述步骤用于10ng-3μg DNA模板的标记反应。如需大量标记（多至10μg DNA），请成比例放大标记反应的试剂用量和反应体积。

标记反应得率

表1：DIG-High Prime不同反应时间的标记反应得率

在DIG-High Prime标准反应体系中（1μg DNA模板），反应1h后，15%的核苷酸掺入到新合成的探针，DIG标记的探针约为0.8μg；反应20h后，38%的核苷酸掺入到新合成的探针，DIG标记的探针约为2μg。

图2：DIG-High Prime法不同DNA模板量的标记反应得率，37℃反应1h或20h

3.3定量标记反应效率

定量原理

DIG标记DNA的得率是杂交反应优化和反应重复性的决定性参数。杂交时使用的探针浓度过高将引起严重的背景，浓度过低将影响杂交信号的获得。

建议通过直接检测的方法定量DIG标记DNA探针的得率。

反应所需的其他试剂

• DIG Wash and Block Buffer Set, DNase and RNase free.*

或下表所列试剂

注意：这些试剂同样用于3.6免疫检测步骤，建议大量制备。

试剂盒试剂的工作液制备

请根据下表制备试剂的工作液：

探针定量

根据前文表1预估合成的探针浓度，在定量实验前将合成的探针和DIG-labeled control DNA （管2）稀释到1ng/μl，以1ng/μl作为起始浓度，将探针进行系列稀释。

注意：探针产量取决于DNA模板量和反应孵育时间。表1中给出的探针产量是采用高纯度DNA模板，在最佳反应条件下获得的。

系列稀释

按照下表对标记的探针和DIG-labeled control DNA进行系列梯度稀释。

操作步骤: 定量标记反应效率

注意：在所有步骤中，使用足够的缓冲液体积将膜完全浸润。