细胞破碎

3.物理渗透法
1.渗透压冲击法 2.冻结-融化法
1.渗透压冲击法
渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将 细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度 的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用， 细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩， 当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细 胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然 变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞 快速膨胀而破裂
化学渗透法选择性释放胞内产物流程图
选择性释放原则：
仅破坏或破碎存在目标产物的位置
细胞膜附近：温和的方法(酶法)，或采用 较温和的机械破碎条件，降低细胞破碎程度。 细胞内：机械破碎
选择性溶解目标产物
目标产物与细胞膜或细胞壁处于结合状态
调整溶液pH、离子强度、添加能够溶解释 放目标产物的试剂(如表面活性剂、螯合剂)。
（2）.自溶
自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体 自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种 能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程 继续下去。可是，改变其生长环境，可以诱 发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶 酶，以达到自溶目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH 值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋 白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大， 过滤速度下降。
破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln kt 1 S
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设计操作 时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参 数较多，过程优化设计较复杂。
影响破碎效率的因素
转盘外缘速度、细胞浓度、珠粒大小及装载量温度、流 速 延长研磨时间，增加珠体装量，提高基 本速度等均可提高细胞破碎率，但高破碎率 ，使能耗加大。同时: 1、产生较多热能，增加冷却控温的难度； 2、大分子目的产物失活增加 3、细胞碎片较小，碎片不易分离，给后续操作带来困难。 因此,破碎率控制在80％以下。
结构—三层三维网状结构
真菌细胞壁：
几丁质（N-乙酰葡聚糖胺的聚合物）、纤维素、葡聚糖、 甘露聚糖、半乳聚糖、蛋白质、脂类、无机盐等 结构—四层三维网状结构
酵母细胞
酵母细胞壁结构示意图 M——甘露聚糖；P——磷酸二酯碱；G——葡聚 糖
3.植物细胞和动物细胞 植物细胞：纤维素 动物细胞：无细胞壁
原核和真核细胞膜：脂质和蛋白构成
2.2
2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4
细胞破碎
细胞的结构 细胞破碎和产物释放原理 细胞破碎技术 目标产物的选择性释放
2.2.1 细胞的结构
1.细菌的细胞壁
8~10nm 1.5~2nm 15~50nm 40~90%肽聚糖
革兰氏阳性和革兰氏阴性的差别： 厚度、紧密度、是否有外 膜
2.酵母与真菌的细胞壁 酵母细胞壁： 由葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质构成，比G+更难破碎。
化学与生物化学渗透的优缺点：
优点： 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的 溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子 量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离 和进一步提取。 缺点： 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50% 有些化学试剂有毒 。
2、珠磨（Bead mill）
高速珠磨机（High speed bead mill） 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、 石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破 碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机 。
高速珠磨机工作原理
破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相 互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。
2. 酸碱处理 破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品 3. 化学试剂处理 (1).表面活性剂处理 十二烷基硫酸钠SDS、Triton X-100等 溶解脂蛋白和脂类，作用细胞壁和细胞膜，增加通透性 动物细胞完全破碎 (2). 有机溶剂处理 甲苯、丙酮等 溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性，可实现选 择性释放。
2.化学和生物化学渗透
1.酶溶 2.酸碱处理 3.化学试剂处理
1.酶溶
（1）.外加酶法
酶溶是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使 细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压 冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物 的通透性。溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏 阴性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时， 需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。 真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不 同的酶。
破碎难易程度
难
2.2.2 细胞破碎和产物释放原理
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破 坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成 分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型 生化物质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展， 以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
破碎方法：
目前已发展了多种细胞破碎方法，以便 适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎主要有三种方法： （1）化学破碎法 （2）机械破碎法 （3）化学和机械破碎法结合
化学破碎法
又称化学渗透法（chemical permeation) 原理：利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁 或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率； 或者完全溶解细胞壁，形成原生质体 （protoplast）后ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在渗透压作用下使细胞膜 破裂而释放胞内物质。
各种微生物细胞壁的结构及组成
微生物 革兰式阳性菌 革兰式阴性菌 酵母
壁厚（nm） 层
20～80 单层
肽聚糖(40~90%) 多糖
10～25 多层
脂蛋白 脂多糖 磷脂 蛋白质 相对易
100～300 多层
甘露聚糖 （30％） 蛋白质 脂类 最难
肽聚糖(5~10%) 葡聚糖(30~40%)
主要组成
胞壁酸 蛋白质 脂多糖
影响破碎的主要因素
压力、温度、通过均浆器阀的次数
升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次 数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀 就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过 小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。Brokman 等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约 175 MPa的压力下，破碎率可达100％，但是也有试验表明 当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢，在工业生产 中，通常采用的压力为55-70Mpa。
动力学方程：高压匀浆法中影响细胞破碎的因素 主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率 S与操作压力P和循环操作次数N之间的关系可表 达为：（服从一级反应规律)
1 b ln kp N 1 s
高压匀浆法适用的范围
适用于微生物细胞和植物细胞的大规模破碎 料液细胞浓度可达到20%左右。 易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳 性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬， 易损伤匀浆阀）不宜使用高压匀浆法。
2.2.4 目标产物的选择性释放
破碎的目的是要得到一种或几种目标产物，因此，在 细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标产物、 而使其它物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞 的破碎程度，对下游的分离纯化操作的顺利实施是非 常重要的。 利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速 率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度 快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓慢释 放出来。因此，选择发现地释放目标产物是可能的。 关键是要知道目标产物的性质和在细胞同存在的位置， 选择适当的破碎方法和操作条件。
机械破碎法
细胞所受的力：压缩力和剪切力。
细胞破碎仅为目标产物的释放创造了条件，而 不是最终目的。
破碎方法小结
2.2.3 细胞破碎技术
1.机械破碎 2.化学和生物化学渗透 3.物理渗透法
1.机械破碎
是工业规模细胞破碎的主要手段 主要基于对物料的挤压和剪切作用。 主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破 碎等
渗透压破坏细胞 -15℃至-20℃冷冻， 再室温下融化，膜的 疏水键被破碎 菌体细胞失水
剧烈 效果
温和 温和
便宜 成本
便宜
技术
渗透冲击 反复冻融法
举例
血红细胞的 破坏
撞击破碎 干燥法 剧烈
机械破碎法VS化学破碎法
机械破碎法 优点：处理量大、破碎效率 高、速度快，适用于工业规 模的细胞破碎 缺点：A操作条件剧烈（高 能、高温、高噪音、高剪切 力，四高)，易使产品变性 失活；易造成细胞过度破碎 ，不利于后续处理 B、非专一性，胞内产物均 释放，分离纯化困难；C、 细胞碎片大小不一，难分离 化学破碎法 优点：选择性高，胞内产物的总 释放率低，料液粘度小，有利于 后处理过程。 缺点：适用范围小，通用性差， 费用高；破碎速度慢，处理时间 长，破碎效率低，不适于大规模 细胞破碎操作。引起新的污染。
1、高压匀浆法（High-pressure homogenization） ——大规模细胞破碎常用方法
阀座
阀杆 撞击环 阀杆 压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
高压匀浆器（High pressure homogenizer）
高压匀浆操作原理
细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环 隙高速(可达到450m／s)喷出后撞击到碰撞环 上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到 低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用 下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为50～ 70MPa。
3.喷雾撞击破碎
原理：细胞冷冻后成为刚性球体，再进行高速撞击而破碎 特点：细胞破碎均匀；可通过调节载气压力控制细胞破碎 程度；适用于细胞器（如线粒体、叶绿体）的回收。
4、超声波破碎（Ultrasonication）
破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生 极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大， 多在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法 机 械 法 技术 原理 效果 成本 举例 动物组织及 动物细胞 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器 劈碎 研磨法
超声波法
适中 适中 适中 便宜
适中 昂贵
细胞被研磨物 磨碎
用超声波的空 穴作用使细胞 破碎
细胞悬浮液 小规模处理 细胞悬浮液 大规模处理
匀浆法（孔型） 须使细胞通过 的小孔，使细 胞受到剪切力 而破碎 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠 或铁珠捣碎
高压匀浆法使用时注意事项
高压匀浆器的操作温度上升约２~３℃/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷 却处理。 多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效 防止温度上升，保护产物活性
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多
WAB公司的AVP Gaulin 31MR型，最大操作压力为 24MPa，最大处理量为100L/h Bran and luebbe 公司SHL40型，最大操作压力为2063MPa，最大处理量为为2.6-34 m3/h
剧烈 适中
剧烈 便宜
细胞悬浮液 和植物细胞 的大规模处 理
方法 化 学 法
技术 酶消化法
原理 细胞壁被消化，使细 胞破碎
效果 温和
成本 昂贵
举例
增溶法
脂溶法
表面活性剂溶解细胞 壁
有机溶剂溶解细胞壁 并使之失稳
温和
适中
适中
便宜
胆盐作用于 大肠杆菌
甲苯破碎酵 母细胞
碱处理法 方法
物 理 法
碱的皂化作用使细胞 壁融解 原理
2.冻结-融化法
将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由 于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破 裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞 内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破 裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 但只适用于细胞壁较脆弱的菌体；破碎率较 低，常需反复多次；冻融中，可能引起某些 蛋白质变性。