重组蛋白质复性
蛋白质复性ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
复性有关理论
“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否
定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二 者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同， 各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假 说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控 制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简 单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复 性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排， 脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热 力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。
蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假 设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白 质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是 “热力学假说”。
该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性， 其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋 白质的天然构象应是能量最小构象。
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复性有关理论
两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分
子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的 疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构 的蛋白质分子。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
蛋白质复性名词解释
蛋白质复性名词解释蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，是构成生物体各种组织和器官的重要成分。
蛋白质的功能多样，可以参与生物体内的酶催化、结构支持、运输、通信、能量存储、免疫防御等重要生理过程。
蛋白质的复性是指它的折叠状态和三维结构。
蛋白质synthesized 是在生物体内通过一系列复杂的生物化学反应合成的，但它不是以线性链的形式存在，而是经过折叠和组装形成复杂的三维结构。
这个过程被称为蛋白质的折叠，而折叠之后形成的三维结构就是蛋白质的复性。
蛋白质的复性是非常关键的，因为它决定了蛋白质的功能和稳定性。
如果蛋白质的复性受到破坏，它可能失去原有的生物活性和功能。
例如，当蛋白质的复性受到变性剂（如酸、碱、高温等）的作用时，蛋白质的结构可能会发生改变，导致其在生物体内无法正常发挥作用。
蛋白质的折叠和复性是一个自发的过程，在正常生理条件下，蛋白质可以自行正确地折叠成其稳定的复性。
但有时蛋白质的折叠过程会出现错位或失败，导致其形成不正确的复性。
这种情况下，被称为蛋白质的错折，错误复性的蛋白质可能会失去原有的功能，甚至产生有害的效应。
蛋白质折叠和复性的控制是一个复杂的过程，涉及到多个层面的调节。
通常，蛋白质的折叠主要由其氨基酸序列所决定，不同氨基酸之间的相互作用力（如氢键、离子相互作用、范德华力等）在折叠过程中扮演重要的角色。
此外，还有一些蛋白质专门参与蛋白质折叠和复性的分子辅助工具，如分子伴侣和分子伴侣辅助因子等，它们能够帮助蛋白质正确折叠和达到稳定的复性。
总之，蛋白质的复性是指其折叠和组装成稳定的三维结构的过程，它对蛋白质的功能和稳定性起着关键作用。
探索蛋白质复性的机制对于理解生物大分子的结构与功能具有重要意义，也对于研究蛋白质相关疾病和开发药物具有重要价值。
名词解释蛋白质的复性
名词解释蛋白质的复性蛋白质的复性：现象与意义在生物化学领域中，蛋白质的复性是一个广泛而重要的研究课题。
复性是指蛋白质经历一系列空间结构和功能的调整，重建其原有的三维结构以及所能发挥的功能。
本文将探讨蛋白质复性的现象、机制以及其在生物体内的意义。
1. 蛋白质的复性现象复性是蛋白质遭受外部环境的一系列不良条件（如高温、极酸或极碱性条件、化学变性剂等）后，通过一定机制修复并重获原有结构与功能的过程。
在这个过程中，蛋白质的一级、二级和三级结构受到损伤，导致其失去正常功能。
蛋白质的复性可以发生在细胞内部和细胞外部。
在细胞内，复性通常由分子伴侣和分子伴侣系统促进，如分子伴侣热休克蛋白HSP70、HSP90等。
这些分子伴侣通过与蛋白质相互作用，引导失去结构的蛋白质重新折叠成正确的形式，并防止其在复性过程中发生聚集。
2. 蛋白质的复性机制复性过程涉及多个事件和步骤，其中最为关键的是解聚和折叠。
解聚是指复性过程中产生的不正常和不稳定的蛋白质聚集体分解为单体。
这个步骤由分子伴侣和其他调节蛋白质负责。
折叠是指蛋白质通过一系列无序到有序的结构变化，重新将其折叠成正确的三维构象。
折叠的过程中，分子伴侣系统与其他辅助蛋白质（如折叠辅助酶和蛋白激酶等）相互作用，协助和促进正确的二级和三级结构的形成。
此外，糖基化也被认为是蛋白质复性的关键机制之一。
在糖基化过程中，糖链与特定氨基酸残基结合，形成糖蛋白复合物。
这种复合物不仅能帮助维持蛋白质的稳定性，还可促进正确的折叠。
3. 蛋白质复性的意义蛋白质的复性在维持生物体内正常的生理功能中起着至关重要的作用。
在细胞内，复性可以防止异常蛋白质的聚集和沉积，减轻内环境的毒性。
此外，蛋白质复性还与许多重要的生物过程密切相关。
例如，蛋白质折叠失常与多种神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病相关。
了解复性过程可以帮助我们深入了解这些疾病的发生机制，并为研发相关的治疗方法提供新的思路。
另外，蛋白质复性也对生物技术领域具有重要意义。
基因重组蛋白包涵体的复性研究
蛋白质与介质的疏水 性相互结合
rhIFN-γ，rhIFN-β， 重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF
离子交换色谱 蛋白质与介质间存在 Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，
（IEC）
电荷作用力
重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白
亲和色谱 （AFC）
需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物 活性的基因工程蛋白
基因重组蛋白包涵体的复性研究
51％
基因重组蛋白包涵体的复性研究
8.2 包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物
包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
基因重组蛋白包涵体的复性研究
影响复性效率的因素
• 4）氧化还原环境
• 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
• 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 • 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基
基因重组蛋白包涵体的复性研究
包涵体形成的几种可能性
• 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 • 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞
内溶解度时沉淀； • 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
梯度透析法及稀释法蛋白的复性
蛋白的复性重组基因在表达宿主中表达量过高或合成速度过快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，导致蛋白以包涵体的形式存在。
导致包涵体形成的主要原因有以下几点：⑴重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
⑵重组蛋白所处的环境：诱导温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
⑶重组蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli)的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
⑷有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
包涵体复性在世界范围内都是个难题，最好的复性方法也不会超过20%。
目前大家在这方面研究也比较多，有研究证明一些分子伴侣有助于蛋白的复性；同时稀释、透析、渗透是最经典的蛋白复性的方法；另外氨基酸如精氨酸、糖类、醇类、表面活性剂对蛋白的复性都有辅助作用，还有很多的表达系统可以助复性。
本公司主要通过梯度透析和稀释的方法对变性蛋白进行复性。
梯度透析法梯度透析缓冲液配方：PBS（1L）：8.0NaCl、28.65gNa2HPO4·12H2O、0.234gNaH2PO4·2H2O缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100 缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、2M脲素缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100、2M盐酸胍溶解缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、10mM β-巯基/乙醇/DTT、2mM脱氧胆酸钠、8M脲素复性缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl (pH8.5)、100mM NaCl、6M/4M/2M脲素、1%甘氨酸、5%甘油、0.2%PEG、1mM氧化型谷胱甘肽、1mM还原型谷胱甘肽包涵体纯化及复性操作步骤：若蛋白以包涵体的形式纯在，则需要从包涵体中纯化出目的蛋白：1、大量诱导表达菌液，5000g离心10min，弃上清，用缓冲液A重悬，超声波破碎，功率45%，工作2s，暂停2s，破碎10min，，10,000g离心10min。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋⽩质复性⽅法及其注意事项蛋⽩质复性⽅法及其注意事项蛋⽩前期准备(1）查阅⽬标蛋⽩相关⽂献，了解其等电点,标签等注意点。
(２）如果⽬标蛋⽩易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理. （３）透析Buffer得选择可参考⽂献。
蛋⽩复性包涵体：在某些⽣长条件下，⼤肠杆菌能积累某种特殊得⽣物⼤分⼦,它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成⽆膜裸露结构,这种⽔不溶性得结构称为包涵体（Iｎclｕsiｏn Bｏｄｉes，ＩB)。
在Ｅ、coｌi中累积得重组蛋⽩会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋⽩就是丧失⽣物活性得不可溶得错误折叠蛋⽩得聚集体.包涵体得处理⼀般包括这么⼏步:包涵体得洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋⽩在包涵体中,那么通常有两个选择可以考虑：（1)退⼀步,优化表达条件；(2）接受包涵体并采取策略来将蛋⽩溶解以及复性.这⾥主要考虑第⼆种⽅案。
包涵体得洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋⽩质或核酸⽔解酶释放到溶液中，使⼤分⼦⽣物降解，导致天然物质量得减少,加⼊蛋⽩酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离⼦强度等，使这些条件都要适合于⽬得物质得提取。
洗涤Bufｆeｒ:50mM Tｒiｓ-HＣl（pH8、0）,2mM EDTA，２mＭD ＴT，１5０mＭＮaCl, 1% Triｔon X—1０0, 1mg/ml Leupeｐｔin, 1mg/ml Ｐepstatｉn，1ｍＭTCEP.超声时⽤40－６０ml裂解液,因为我们得超声仪很适合⽤１0０ml⼩烧杯，装４0—60mｌ裂解液，这样能让超声头离液⾯不⾼不低，不会洒出来、菌多就延长超声时间（全程冰浴）.包涵体得溶解１、对于尿素与盐酸胍得选择：尿素与盐酸胍属中强度变性剂,易经透析与超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强得可逆性变性作⽤，所需浓度尿素8-1０Ｍ，盐酸胍6—8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢⽽弱，溶解度为７0－90％,尿素在作⽤时间较长或温度较⾼时会裂解形成氰酸盐,对重组蛋⽩质得氨基进⾏共价修饰,但⽤尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低,蛋⽩质复性后除去不会造成⼤量蛋⽩质沉淀以及溶解得包涵体可选⽤多种⾊谱法纯化等优点，故⽬前已被⼴泛采⽤。
蛋白质复性技术
一、基本原理
• （4）色谱复性：在色谱的过程中实现复性， 称为色谱复性法。优点在于，色谱固定相 对变性蛋白质吸附性能低，甚至完全消除， 变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集， 产生沉淀。提高复性质量和活性收率。在 蛋白质复性 的同时可使目的蛋白质与杂质 蛋白质分离，达到复性和纯化的双重效果。
一、基本原理
蛋白质复性
一、基本原理
1、包含体 • 是指以大肠杆菌为宿主细胞的基因表达产物由 于不能分泌到细胞外，而在细胞内聚集形成的 没有生物活性的固体颗粒。 • 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体 元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、 ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以 及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很 高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶 性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
一、基本原理
• （2）洗涤：为了除去包含体上粘附的杂质， 如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包含体， 通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或 盐酸胍会使包含体溶解，如2M尿素洗涤。 此外可以用温和去垢剂洗涤去除膜碎片和 膜蛋白。
一、基本原理
• （3）溶解：一般用强的变性剂如尿素、盐 酸胍通过离子间的相互作用，打断包含体 蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使 多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素， 因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使 尿素不能溶解的包含体溶解，而且尿素分 解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲 酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。
一、基本原理
3、蛋白质复性
• 由于包含体中的重组蛋白缺乏生物学活性， 加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构 破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。 通去除还原剂使二硫键正常形成。
一、基本原理
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦
![[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦](https://img.taocdn.com/s3/m/b6184610ef06eff9aef8941ea76e58fafbb04554.png)
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。
大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。
但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。
包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。
但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。
现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。
第一节包涵体形成的原因,(什么是包涵体所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如Cys含量高)，如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。
包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度(约1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。
包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。
有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。
一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用[发明专利]
![一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f6863ecaaff8941ea76e58fafab069dc502247e2.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.03.12C N 103626834A (21)申请号 201310668749.9(22)申请日 2013.12.11C07K 1/14(2006.01)(71)申请人江苏省农业科学院地址210014 江苏省南京市玄武区钟灵街50号(72)发明人李辉 施振旦(74)专利代理机构江苏圣典律师事务所 32237代理人孙忠浩(54)发明名称一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用(57)摘要本发明涉及一种重组蛋白复性缓冲液及其配制方法和应用，所述缓冲液由基础液和5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20、10mM 的β-环糊精、1M 的L-半胱氨酸以及4M 的尿素组成；其配制方法为先向基础液中加入4M 的尿素；后加入体积比为5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20以及10mM的β-环糊精和1M 的L-半胱氨酸，即形成重组蛋白复性缓冲液；本发明所述缓冲液应用于初始蛋白浓度高于1mg/mL 的重组蛋白复性，操作简单，成本低，方便工业化生产，复性后蛋白体积增大较少，蛋白浓度稀释较小，并且复性率较高。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书4页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页(10)申请公布号CN 103626834 A1/1页1.一种重组蛋白复性缓冲液，其特征在于，所述缓冲液由基础液和5‰的β-巯基乙醇、1%的吐温-20、10mM 的β-环糊精、1M 的L-半胱氨酸以及4M 的尿素组成；所述基础液包括20mM 的Tris-HCl 、200mM 的NaCl 和无菌水。
2.一种如权利要求1所述的缓冲液的配制方法，其特征在于：A)基础液的配制：在无菌水中加入 20mM 的Tris-HCl 、 200mM 的NaCl ，调节pH 为8.0；B)向步骤A 所述基础液中加入4M 的尿素；C)向步骤B 溶液中加入体积比为5‰的β-巯基乙醇 、 1%的吐温-20 以及10mM 的β-环糊精 和1M 的L-半胱氨酸，形成重组蛋白复性缓冲液。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
蛋白质复性
重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。
但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。
低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。
筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。
包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法[发明专利]
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专利名称：一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法专利类型：发明专利
发明人：梁毅,周兵瑞,杜芬,周拯,莫重瑛,陈杰
申请号：CN200810047357.X
申请日：20080417
公开号：CN101260139A
公开日：
20080910
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种提高变性重组蛋白质复性产率的方法。
该方法涉及将多糖(包括多聚葡萄糖及多聚蔗糖如Ficoll 70、Ficoll 400、dextran 70)或聚乙二醇(如PEG 2000、PEG 3350及PEG 20000)、蛋白质(如牛血清白蛋白BSA)及核酸(DNA或RNA)等生物大分子物质配制成一定浓度的混合大分子拥挤试剂复性缓冲液，利用混合大分子拥挤试剂对蛋白质复性过程的有利影响，从而有效地提高蛋白质复性产率。
本发明涉及的方法简单且易于操作，材料试剂相对低廉，能显著提高变性重组蛋白质的复性产率并获得具有生物活性的蛋白质，有利于工业或医用放大生产。
申请人：武汉大学
地址：430072 湖北省武汉市武昌珞珈山
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：王敏锋
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重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。
但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。
低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。
筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。
包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
4、包涵体的溶解去折叠一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。
盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，尤其在碱性条件下，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化。
高浓度的变性剂会严重破坏蛋白质的二级结构，产生不可逆变性，导致无法复性。
包涵体溶解时要采用尽可能低的变性剂浓度。
极端pH和变温被用来溶解包涵体，以替代高浓度的变性剂。
但高pH值会降解蛋白质的N端。
用去垢剂SDS、TritonX-100、Sarkosyl等，破坏蛋白内的疏水键，溶解包涵体蛋白质。
对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间和链内的非活性二硫键，需加入还原剂，如巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇等破坏二硫键。
当蛋白表达量很高时，包涵体的在位溶解是一种非常有效的方法。
但在位溶解会引起许多杂质成分的释放，导致蛋白质复性的收率下降。
二、包涵体蛋白质的复性折叠机制（几种假说）蛋白质的一级结构完全包含了形成高级结构的全部信息，其组成中的氨基酸本身的特性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础。
多肽链的折叠是一个自发的过程，主要取决于给定氨基酸的序列，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。
多年来，在蛋白质折叠的研究中存在许多假说，最初的假设都认为折叠步骤为：二级结构小片段形成折叠核，此核再形成功能区域，形成“熔球态”，此后，分子立体结构再做一些局部调整，最终形成正确的立体结构。
传统的化学动力学的模型集中研究此中间态转换机制。
近年来关于蛋白的折叠过程和机制的研究很多，多维能量观（Multidimensional energy landscape）学说或折叠漏斗（Folding funnel）比较有代表性。
多维能量观和折叠漏斗的模型可以预测蛋白复性的多动力路径，实验证明蛋白复性是远多于“熔球态”一个折叠路径的。
而统计学的研究则侧重于蛋白向复性状态转换的整体能量观。
Dill, K.A的观点，认为蛋白复性更像多个球沿轨道滚落，而不是一个球在平面上漫无目的的滚动。
可用能量和适合度的景观来解释，此能量景观把单个的微观行为和宏观的现象联系起来，涉及折叠动力学的波动平衡，并发展了新型快速的计算方法。
折叠动力学应用微观理论和模型来研究，这个模型展示了蛋白折叠可用漏斗型的能量景观来描述(如图1)。
漏斗的深度代表稳定构像的侧链相互作用的自由能，而宽度代表侧链的熵。
在低的位置，能量景观表示能量更低，更接近天然结构，此时构像就越少。
漏斗模型可以模拟大量的变性分子从不同构像如何快速折叠为一个天然结构，但无法说明能量的屏障作用。
图1：此模型说明蛋白复性的能量景观像漏斗型。
还有研究人员从拓扑学的角度来解释蛋白的折叠过程，认为蛋白质折叠是由其拓扑学性质决定的，在无数空间结构中，具有生理活性的蛋白质结构是唯一的，并且此拓扑结构的熵值最小。
熵是度量系统无序度的函数，蛋白质的折叠过程是一个熵值不断减小、从无序的松散肽链到有序的活性蛋白质结构的演变过程。
这些构像的拓扑学分析中天然型的构像最稳定，热力学稳定性增加。
三、包涵体蛋白体外复性方法复性是一个非常复杂的过程，与蛋白质复性的过程控制相关，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关。
1、传统方法：稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，耗时长。
超滤复性：处理样品规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中产生不可逆的变性，在膜上聚集造成污染。
成功的复性方法是能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。
一是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。
在两次之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过易聚集的中间体阶段。
第二种方法是用温度跳跃策略。
变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠。
第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又能够引发正确复性。
2、添加辅助剂的复性方法：在包涵体蛋白质折叠复性过程中，加入辅助剂能大大促进复性效率。
其作用为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体和非折叠蛋白质的溶解性。
通常使用的添加剂有：（1)共溶剂如PEG6000-20000，通过与中间体特异而形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集沉淀。
（2)去污剂及表面活性剂如Trition X-100、SDS、CHAPs、Tween、磷脂、磺基甜菜碱等，对蛋白质复性有促进作用，但能与蛋白质结合形成微束，很难去除。
（3)氧化-还原剂对于含有二硫键的蛋白，复性过程应促使二硫键形成。
方法有：空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法等等。
最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG，cysteine/cystine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也应用，氧化还原系统促进不正确形成的二硫键快速交换，提高了正确配对的二硫键的产率[61]；常使用1-3mM还原型巯基试剂，还原型和氧化型巯基试剂的比例常为10：1～5：1。
Hevehan认为这一比例关系应需随蛋白质浓度作调整。
空气中的氧是很好的二硫键氧化剂，很多包涵体蛋白成功地利用空气中的氧完成复性。
金属离子如Cu、Zn等常被用来作为催化剂。
还有一些特殊的氧化剂被用做控制包涵体蛋白的氧化复性，如：用O-iodosobenzoate 来氧化复性IFN-β，IL-2。
（4)小分子的添加剂小分子自身并不能加速蛋白质的折叠，而是通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。
如盐酸胍或尿素等，可阻止蛋白聚集；蛋白质的辅因子（如Zn2+或Cu2+）、配基或底物亦起到很好的促折叠作用；加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率；L-Arg能使不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠朝着正确的方向进行。
；NDSBs可促进蛋白复性，它不属于去垢剂，不形成微束，易于去除；肝素具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会以提高复性效率；适量的盐可降低某些带电基团间的斥力，利于蛋白质的折叠；短链醇、高渗物等能有效地降低聚集体的形成，稳定蛋白的作用。
（5)添加分子伴侣和折叠酶分子伴侣GroE家族的研究很多。
有些学者已成功地利用分子伴侣在体内和体外辅助蛋白质复性。
也有利用固定化分子伴侣，在体外辅助一些蛋白酶的折叠复性。
还有利用“小分子伴侣”对目标蛋白质进行复性。
“小分子伴侣”是GroEL的一个片段，分子较小，更适合于固定化，不需另加复性辅助因子。
与分子伴侣辅助复性的作用机制相似，环糊精分子对去污剂分子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来，从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白质。
（6)单克隆抗体待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限与抗体相对应的蛋白才能获得明显的助折叠作用。
（7)使用高压力复性蛋白。
3、液相色谱复性法液相色谱复性的优点是：在进样后可很快地除去变性剂；色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集；在蛋白质复性的同时，分离目标蛋白质与杂蛋白，达到纯化的目的。
有资料报道，疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功地对变性蛋白进行了复性。
色谱法中，SEC的分离效果是最差的，盐酸胍会在IEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来，AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，HIC是其中较为理想的。
耿信笃研制成功变性蛋白复性及同时纯化装置。
谷振宇等提出用脲梯度SEC复性：在SEC柱中预先制成自上而下脲浓度逐渐降低的梯度。
4、反胶束复性法蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内，这样使蛋白质相互分离，减少相互聚集，逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原剂，使变性蛋白质复性。
5、双水相复性法使用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统，PEG具有稳定蛋白质构象的作用、高浓度盐则具有去稳定的作用，这样正确折叠的蛋白质会不断从一相进入到另一相中，直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡。
目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不十分清楚，每种蛋白质都有自己特有的折叠方式和途径，对某种蛋白质的复性必须反复试验，且没有普遍性。