光学显微镜的使用和显微绘图

如按上述操作仍看不到物像时，可能由下列原因造 成： ①观察的部分不在视野内，应在低倍镜下寻找到后 ，移到视野中央，再换高倍镜观察。 ②标本片放反了，应把标本片放正之后，再按上述 步骤操作。 ③焦距没调好，应仔细调节焦距。 如需要更换标本片时，应该先把载物台下降，然后 把标本片移到载物台前方，再取下。
• 油镜（镜口率一般在1.25左右）的分辨率在0.2m左右，这就是 光学显微镜的分辨极限。
表1 几种物质的折射率
介质
空气
水
折射率（n） 1.003
1.33
石蜡油 1.47
香柏油 1.515
加拿大树胶 1.515
光学玻璃 1.54
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五、显微镜的使用方法
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实验 1 光学显微镜的使用
及显微绘图
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一、目的要求
• （1）熟悉显微镜的结构和各部件性能。
• （2）掌握低倍镜/高倍镜的正确使用方法，掌 握油镜的使用方法。
• （3）掌握显微绘图的基本方法
• （4）了解细胞的基本结构，动物、植物和微 生物细胞的基本共性和特性
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二、仪器设备及材料
• 1. 光学显微镜/显微照相系统（带油浸物镜） • 2. 目镜测微尺及镜台测微尺 • 3. 香柏油、二甲苯 • 4. 永久装片、擦镜纸
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普通生物显微镜
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（5）换10 X 物镜观察。此时，只须稍稍调节细调节旋钮即可。
低倍镜的使用
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Fra Baidu bibliotek
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低倍镜的使用
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如果按上述操作步骤仍看不到物像时，可能由以下原因造成： ① 转动调节钮太快，超过焦点。应按上述步骤重新调节焦距。 ② 物镜没有对正，应对正后再观察。 ③ 标本没有放到视野内，应移动标本片寻找观察对象。 ④ 光线太强，尤其观察比较透明的标本片或没有染色的标本时，
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三、显微镜的构造
• 3．显微镜的能力 显微镜的能力是质量和性能的标志。
能力包括分辨率、放大率、焦点深度和视 场宽度等，其中最重要的是分辨率。
R 0.61
N.A.
R：分辨率（分辨的两个点的最短距离）， R值愈小，分辨率越大。
λ：照明光线的波长(可见光平均波长 约550nm）。
•使用显微镜的要领就是从低倍物镜开始观 察，先粗调后细调。
在低倍物镜下找到要观察的东西后， 再逐步加大物镜倍数，仔细观察。
低倍镜的使用
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（1）检查：各部件有无损坏，如发现问题，立即报告教师请求处理。 （2）准备：将显微镜放于前方略偏左侧以便观察。打开电源开关，观察 底座的光路中是否有光亮。慢慢调节同一旋钮，光线应逐步增强。转动粗调 节钮，将载物台下降使物镜与载物台距离略拉开。再旋转物镜转换器，将低 倍镜4 X对准载物台中央的通光孔（可听到“咔哒”声）。 （3）放标本片：标本片标签面向上，用标本夹夹好，把要观察的部分移 到通光孔的正中央。 （4）调节焦距：边从目镜中观察，边调节粗聚焦旋钮，使载物台缓慢上 升，直至视野中出现物像为止。如物像不太清晰，可转动细调节钮，使物像 更加清晰。
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四、油镜的原理
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• 油镜（油浸系物镜，通常有黑圈或Oil的标志），以香 柏油或石蜡油为介质。这类油的折射率与玻璃的折射率 大致相同。光线从被检物体直接射入物镜，其间因折射 或反射而引起的光线损失很小，所以可以充分利用镜口 角，显著提高物镜的分辨率。
N.A. nsin
2
N.A.：物镜的镜口率 n：物镜和被检物体之间介质的折射率 α：物镜的镜口角（从物镜光轴上的物点所发出 的光线与物镜前透镜有效直径边缘所张的角度）。
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表1 在550nm光波下不同物镜的分辨距离
放大倍数（×） 镜口率（N.A.） 分辨距离（d）
易出现这种现象，应将光线调暗一些后，再观察。
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高倍镜的使用
（1）依照低倍镜操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。 （2）将需要观察的部分移到视野的中央。 （3）眼睛从侧面注视物镜，用手移动转换器，换高倍镜40X。 （4）眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动细调节钮，直至视野内看到清晰 的物像为止。此时应把聚光器的孔径光阑适当调大，使之与物镜的镜口率相匹 配。光源的强度也应调高。
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显微照相系统
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三、显微镜的构造
• 1．机械部分
支持和调节光学系统
Charge-coupled Device
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三、显微镜的构造 • 2．光学系统
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油镜的使用
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应先调低倍镜、高倍镜找到要观察的物像，然后再用油镜观察，操作如下： （1）先用低倍镜观察标本，然后更换高倍镜，把待观察的部分移到视野中央。 （2）把载物台下降约1.5厘米，再把油镜转到工作位置。 （3）在盖玻片上所要观察的位置滴一小滴香柏油。 （4）细心拧动粗调焦螺旋，使载物台慢慢上升。这时要仔细观察物镜前端与标 本之间的距离，先使物镜前端与油滴接触，然后再慢慢使载物台上升，至物镜前 端接近而没有碰到盖玻片为止。这步操作要特别小心，防止油镜压碎标本或损坏 油镜（油镜的工作距离约0.2mm）。 （5）眼睛要看目镜中，拧动细调焦螺旋，使载物台慢慢下降到能看清标本。这 步操作要特别注意不要把细调焦螺旋的方向拧错，以防压碎标本。 （6）看清标本后，把聚光器下的孔径光阑开到它的口径与视场的直径恰好一样 大，使聚光器的镜口率与物镜的镜口率相配合。如果聚光器的镜口率小于物镜的 镜口率，则物镜的镜口率就不能充分发挥。 （7）观察完毕后，下降载物台，把油镜转离光轴，立即作清洁工作。先用干的 擦镜纸擦一、二次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦两次，最后再 用干擦镜纸擦一次。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要 细心，动作要轻，不可用力擦。如果聚光器上有滴油也要同样清洁。载玻片上的 油可用“拉纸法”擦净，即把一小张擦镜纸盖在载玻片油滴上，在纸上滴一些二 甲苯，趁湿把纸往外拉，这样连续作3—4次，即可干净。
10 0.28 1μm
40 0.65 0.42μm
100 1.25 0.22μm
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科勒照明
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优点：视场照明均匀，样品不受热，不产生耀眼眩光，影像清晰。
1893年德国杰出的学者August Kohler提出柯勒照明法。其具体做法：在光源与聚光器之 间，加放一光源聚光镜和视场光阑，光源聚光镜把光线集成光锥，使光源灯成像于聚光器的 孔径光阑平面处。同时，聚光器又使视场光阑成像在样品平面处。由此充分地利用了照明光 源，使点状的光源达到较大的照明，从而使样品得到均匀的照明，并防止了高温。这对显微 摄影和镜检观察至关重要。