血友病B的基因治疗

中华血液学杂志2013-10-15分享

血友病B是一种X染色体连锁隐性遗传病，因编码基因的改变而导致凝血因子Ⅸ（F Ⅸ）的缺乏。在男性中发病率约为1/25 000 ，依据血浆FⅨ活性（FⅨ∶C）分为重型（F Ⅸ∶C<1%）、中间型（F Ⅸ∶C 1%~5%）和轻型（F Ⅸ∶C >5% ，≤40%）。

目前该病主要治疗手段为替代治疗（输注血浆提取物或重组FⅨ制剂），但反复输注外源性FⅨ可引起FⅨ抑制物形成、血制品输注相关疾病且医疗费用昂贵。

基因治疗则为血友病的长期缓解乃至治愈带来了希望。靶组织或细胞选择范围广泛、F Ⅸ基因片段小、低水平表达即可明显改善出血、具有良好的动物模型等优势，使得血友病B 成为基因治疗领域进展最为迅速的疾病之一。

一.载体系统

1.腺相关病毒载体：腺相关病毒载体（AAV）是目前血友病B基因治疗最有前景的载体。AAV是一种可感染人细胞、具有天然复制缺陷的单链DNA 病毒，与已知人类疾病无关。AAV较之其他病毒载体具有免疫原性弱、转染效率高、可转染非分裂细胞、表达稳定且持续时间长等优点，缺点为容量小、基因表达滞后。

AAV包括AAV1、2、5、6、7、8、9 等多种血清型。AAV2 是应用最早、最广泛的血清型，可有效转染多种细胞，但人类是AAV2的天然宿主，人群中AAV2血清抗体阳性者较为常见。其他几种血清型则有不同的转染趋向性：AAV1具有明显的骨骼肌趋向性，AAV6具有心肌趋向性，AAV8具有明显的肝趋向性。针对不同的靶组织可以考虑选择趋向性不同的AAV。

总体而言，AAV7、8、9 产生的免疫反应较AAV1、2、5 轻。Wang 等分别应用AAV1、2、5、7、8、9 对FⅨ基因敲除小鼠和患血友病B犬进行基因治疗，然后对血浆中FⅨ∶C、抗FⅨ特异性IgG1 和IFN-γ进行检测，以比较其转染效率和免疫反应。

结果显示以肌肉组织作为靶组织时，AAV7、8、9 转染效率高于AAV1、2、5，未发现针对导入的FⅨ基因的B细胞反应，针对病毒衣壳蛋白的T细胞反应程度亦较弱。自身互补AAV 载体（self-complementaryAAV, scAAV）的发明则弥补了传统单链AAV 载体（singlestrandedAAV, ssAAV）表达滞后的缺点。

ssAAV表达滞后的原因在于其进入靶细胞并脱壳后，首先要合成互补DNA链才能进一步表达。scAAV则是将载体基因设计成1 个单链反向重复序列，当载体进入靶细胞后即可折叠形成1 条互补双链，从而绕开影响基因表达速度的步骤。

Nathwani 等采用scAAV5 和scAAV8 作为携带FⅨ编码基因的载体对患血友病B猕猴进行基因治疗并研究其安全性。研究者将猕猴分为5 组，分别从外周静脉注射

2×109~2×1012 载体基因组（vg）/kg 共5 个剂量级的载体，然后对基因表达效率和安全性进行了长达5 年的观察。

研究发现，当载体剂量达到6×1010 vg/kg 时，猕猴血浆FⅨ∶C维持在1%以上；所有的猕猴均产生了血清型特异性抗体，未发现衣壳蛋白特异性T细胞反应和免疫介导的肝损伤，同时没有观察到AAV基因整合到靶细胞基因序列中和肝脏肿瘤的发生。该研究及大量制备scAAV的方法为临床试验打下了基础。AAV的缺点为包装容量较小，影响了在血友病A等其他基因缺陷性疾病的应用。

2.逆转录病毒载体：

逆转录病毒载体（RV）是最早应用于基因治疗的病毒载体，但仅对分裂细胞有效，对非分裂细胞则无效。Zhang 等以RV作为载体、以肝脏作为靶组织对新生血友病B犬和新生基因敲除血友病B小鼠进行基因治疗，结果显示所有动物中FⅨ∶C>10%，无FⅨ抑制物形成。

但成年动物的肝脏中分裂细胞不足，有报道以手术切除部分肝脏的方法诱导肝细胞增殖，再应用RV进行基因治疗，但该治疗方法创伤较大，与其他载体相比劣势较为明显。

3.腺病毒载体：

腺病毒载体（AV）可转染分裂细胞和非分裂细胞。腺病毒基因不与宿主基因整合，不会因为基因整合而导致抑癌基因失活。人群可天然感染腺病毒而易预存免疫反应。第二代AV（高容量AV）腺病毒本身的编码基因被去除，可以降低宿主免疫反应，延长导入基因表达持续的时间。

4.慢病毒载体：

慢病毒载体（LV）是以HIV-1 为基础发展起来的基因治疗载体，可转基因至分裂细胞和非分裂细胞，对包括肝在内的各种组织都可转染，也可将载体基因整合至宿主基因中。因为LV来源于HIV，在普通人群中少有感染，很少有预存免疫反应，在基因治疗上具有一定的优势。

但是应用LV作为载体进行基因治疗时，FⅨ∶C仅接近1%，且有一过性急性促炎性免疫反应发生。Brown等应用携带肝细胞特异性启动子的LV载体对基因敲除血友病B小鼠进行治疗，FⅨ∶C因抗FⅨ的T细胞反应而未达治疗水平（<1%），当他们在载体中再包进一段造血特异性miRNA后进行基因治疗，小鼠体内FⅨ∶C持续高于15%且未发生明显的免疫反应，分析认为，miRNA可能在T细胞反应的免疫失活中起了重要作用。

Mátrai 等报道应用整合酶缺陷的慢病毒载体对基因敲除血友病B小鼠进行基因治疗，在基因有效表达的前提下诱导抗原特异性免疫耐受，并降低基因插入诱变的风险。

5. 非病毒载体系统：

非病毒载体包括脂质体、纳米材料、沉默转座子、质粒DNA注射等，具有来源广泛、成分明确、免疫反应低、可大量制备等优点。而缺点在于转染效率低、FⅨ难以长期表达。

Miao 等报道显示小鼠肝内注射裸质粒DNA的同时结合超声波空化可以显著提高转染效率。经小鼠尾静脉高压注射编码FⅨ的裸质粒DNA，达到了良好效果。相比较其他非病毒载体，沉默转座子可以使FⅨ基因整合到宿主基因而长期表达，显示出一定的发展优势。

二.靶点的选择

1.肝脏：肝脏是产生FⅨ的主要器官，是基因治疗较为理想的靶器官。早期通过肝动脉或门静脉注射载体，一些具有肝趋向性的新载体（如AAV8）可采用静脉注射，使治疗过程简化、风险降低。血友病B（尤其是重型）患者常因为血制品输注而并发肝炎，不宜选择肝脏作为靶器官。

2.肌肉组织：肌肉组织是FⅨ的异位合成组织，也是一个重要的治疗靶点，对于合并肝炎的患者尤为适合。载体一般采用多部位肌肉注射，肌肉组织中可长期表达FⅨ。

Buchlis 等报道1 例血友病B患者在接受基因治疗（载体为AAV2 肌肉注射）10 年后因非治疗相关原因死亡，注射部位肌肉组织仍可表达FⅨ，但由于免疫反应，该患者血浆FⅨ∶C未达治疗水平。

采用加压注射或合并使用血管活性药物的静脉灌注给药法（ATVRX）可使载体在肌肉组织中广泛分布。短程应用环磷酰胺以抑制免疫反应可使血浆FⅨ∶C持续维持在治疗水平以上，且安全性较为理想。

3.造血干细胞、红细胞和血小板：除了传统的靶组织，有研究者致力于FⅨ基因异位表达的探索。Bigger 等以慢病毒作为载体，体外转染小鼠造血干细胞，再植入经致死量照射的普通小鼠及基因敲除血友病B小鼠体内，结果受鼠体内表达FⅨ持续1 年以上；再将受鼠的造血干细胞进行二次和三次移植，二次或三次移植受鼠也可长期表达FⅨ，凝血功能得到显著改善。

另有报道使FⅨ表达于干细胞来源的红细胞，也获得良好效果。Zhang 等建立2bF9 转基因小鼠模型，使其FⅨ异位表达于血小板和巨核细胞，并储存在α颗粒中，虽然血浆FⅨ∶C仅1.1%，但其中90%的FⅨ位于血小板，当血小板激活后FⅨ可立即释放到出血部位，止血效果优于普通FⅨ，且具有更长的半衰期。该研究中转基因小鼠未发生肿瘤和血栓性事件。这些研究为血友病B的基因治疗开拓了思路。

三.安全性